| 中文摘要 | 第3-8页 |
| ABSTRACT | 第8-13页 |
| 缩略词表 | 第20-21页 |
| 主要仪器 | 第21-22页 |
| 第一章 文献综述 | 第22-44页 |
| 1 原始生殖细胞 | 第22-35页 |
| 1.1 原始生殖细胞的起源与迁移 | 第22-24页 |
| 1.2 原始生殖细胞的生物学特性 | 第24-25页 |
| 1.3 原始生殖细胞的研究进展 | 第25-26页 |
| 1.4 原始生殖细胞的应用 | 第26-27页 |
| 1.5 原始生殖细胞形成的调控因素 | 第27-35页 |
| 1.5.1 关键基因对PGCs形成的调控 | 第27-29页 |
| 1.5.2 信号通路对PGCs形成的调控 | 第29-31页 |
| 1.5.3 生长因子对PGCs形成的调控 | 第31-33页 |
| 1.5.4 表观遗传对PGCs形成的调控 | 第33-35页 |
| 2 本研究的目的和意义 | 第35页 |
| 参考文献 | 第35-44页 |
| 第二章 鸡C1EIP生物信息学分析及亚细胞定位研究 | 第44-64页 |
| 1. 实验材料与方法 | 第45-52页 |
| 1.1 实验材料 | 第45-46页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第45页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第45-46页 |
| 1.2 实验方法 | 第46-52页 |
| 1.2.1 候选特异基因的生物信息学分析 | 第46-47页 |
| 1.2.2 如皋黄鸡生殖嵴组织cDNA文库的建立 | 第47页 |
| 1.2.2.1 如皋黄鸡生殖嵴组织总RNA提取 | 第47页 |
| 1.2.2.2 如皋黄鸡生殖嵴组织cDNA文库的建立 | 第47页 |
| 1.2.3 C1EIP真核表达载体构建 | 第47-48页 |
| 1.2.3.1 pEGFP-C1EIP融合表达载体的构建 | 第48页 |
| 1.2.3.2 pcDNA3.0-C1EIP真核表达载体的构建 | 第48页 |
| 1.2.4 鸡DF1细胞培养、传代、冻存、复苏及转染 | 第48-50页 |
| 1.2.4.1 DF细胞的培养及传代 | 第48-49页 |
| 1.2.4.2 DF1细胞的冻存及复苏 | 第49-50页 |
| 1.2.4.3 DF1细胞的转染 | 第50页 |
| 1.2.5 C1EIP真核表达载体表达产物中C1EIP mRNA检测 | 第50页 |
| 1.2.6 基因免疫法制备抗鸡C1EIP血清 | 第50-52页 |
| 1.2.6.1 免疫程序 | 第50页 |
| 1.2.6.2 抗C1EIP血清效价的检测 | 第50-51页 |
| 1.2.6.3 抗C1EIP血清特异性的检测 | 第51-52页 |
| 2 实验结果 | 第52-60页 |
| 2.1 C1EIP生物信息学分析结果 | 第52-54页 |
| 2.1.1 C1EIP蛋白质结构及功能的生物信息学分析 | 第52页 |
| 2.1.2 蛋白质的二级结构分析 | 第52-53页 |
| 2.1.3 蛋白质的三级结构分析 | 第53页 |
| 2.1.4 亚细胞定位和蛋白质信号肽预测 | 第53页 |
| 2.1.5 蛋白质功能结构域预测 | 第53页 |
| 2.1.6 磷酸化位点预测 | 第53页 |
| 2.1.7 糖基化位点预测 | 第53-54页 |
| 2.1.8 基因及蛋白质的同源分析 | 第54页 |
| 2.2 鸡C1EIP真核表达载体构建与鉴定 | 第54-56页 |
| 2.3 鸡C1EIP异位表达及亚细胞定位 | 第56-57页 |
| 2.4 转染细胞基因转录水平表达检测 | 第57-58页 |
| 2.5 转染细胞C1EIP-EGFP融合蛋白表达检测 | 第58页 |
| 2.6. 基因免疫法制备抗鸡C1EIP血清 | 第58-60页 |
| 2.6.1 IFA检测抗血清效价 | 第58-59页 |
| 2.6.2 抗体特异性检测 | 第59-60页 |
| 3 讨论 | 第60-61页 |
| 4 本章小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-64页 |
| 第三章 C1EIP调控鸡PGCs生成的功能研究 | 第64-93页 |
| 1 材料与方法 | 第64-72页 |
| 1.1 实验材料和试剂 | 第64-65页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第64页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第64-65页 |
| 1.2 实验方法 | 第65-72页 |
| 1.2.1 C1EIP慢病毒干扰载体构建及慢病毒包裹 | 第65页 |
| 1.2.2 慢病毒干扰载体干扰活性检测 | 第65-66页 |
| 1.2.3 ESCs的分离培养与鉴定 | 第66页 |
| 1.2.4 体外诱导检测 | 第66-68页 |
| 1.2.4.1 鸡ESCs体外诱导分化试验 | 第66-67页 |
| 1.2.4.2 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 | 第67-68页 |
| 1.2.4.3 细胞免疫化学检测相关抗原 | 第68页 |
| 1.2.4.4 流式细胞分析检测PGCs比例 | 第68页 |
| 1.2.5 体内鸡胚慢病毒注射 | 第68-72页 |
| 1.2.5.1 慢病毒对鸡孵化率影响的摸索 | 第68-69页 |
| 1.2.5.2 慢病毒整合鸡胚基因组检测 | 第69-70页 |
| 1.2.5.3 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 | 第70-71页 |
| 1.2.5.4 PAS染色法检测PGCs | 第71页 |
| 1.2.5.5 免疫组织化学检测 | 第71页 |
| 1.2.5.6 流式细胞分析检测各组PGCs比例 | 第71-72页 |
| 1.2.7 统计分析 | 第72页 |
| 2 实验结果 | 第72-88页 |
| 2.1 慢病毒RNA干扰质粒C1EIP-shRNA和阴性对照质粒的构建 | 第72-74页 |
| 2.2 慢病毒干扰载体干扰活性检测 | 第74-75页 |
| 2.3 体外诱导检测 | 第75-81页 |
| 2.3.1 ESCs形态变化观察 | 第75-77页 |
| 2.3.2 体外PGCs生成效率检测 | 第77-81页 |
| 2.4 体内鸡胚慢病毒注射 | 第81-88页 |
| 2.4.1 慢病毒注射剂量对鸡孵化率影响的摸索 | 第81-82页 |
| 2.4.2 慢病毒整合鸡胚基因组检测 | 第82-84页 |
| 2.4.3 PGCs生成效率检测 | 第84-88页 |
| 3 讨论 | 第88-90页 |
| 4 本章小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-93页 |
| 第四章 影响鸡C1EIP转录调控因素的探究 | 第93-116页 |
| 1 材料与方法 | 第93-101页 |
| 1.1 实验材料和试剂 | 第93-94页 |
| 1.1.1 实验材料和载体 | 第93页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第93-94页 |
| 1.2 实验方法 | 第94-101页 |
| 1.2.1 如皋黄鸡C1EIP启动子区域的生物学信息学分析 | 第94页 |
| 1.2.2 鸡胚全基因组的提取 | 第94页 |
| 1.2.3 真核表达载体pC1EIP-EGFP的构建 | 第94-96页 |
| 1.2.3.1 C1EIP启动子区域克隆 | 第94页 |
| 1.2.3.2 PCR产物和载体的酶切、连接反应 | 第94-95页 |
| 1.2.3.3 连接产物转化感受态 | 第95页 |
| 1.2.3.4 阳性菌落鉴定 | 第95-96页 |
| 1.2.4 鸡C1EIP启动子活性定性分析 | 第96页 |
| 1.2.4.1 DF1细胞的冻存与复苏 | 第96页 |
| 1.2.4.2 pC1EIP-EGFP质粒去内毒提取 | 第96页 |
| 1.2.4.3 pC1EIP-EGFP质粒转染 | 第96页 |
| 1.2.5 鸡C1EIP核心启动子区域的鉴定 | 第96-99页 |
| 1.2.5.1 鸡C1EIP启动子各缺失片段的克隆及亚克隆 | 第96-98页 |
| 1.2.5.2 PGL3-basic重组载体的构建与鉴定 | 第98-99页 |
| 1.2.5.3 鸡C1EIP启动子核心区域鉴定 | 第99页 |
| 1.2.6 鸡C1EIP核心启动子区域调控元件的分析 | 第99-100页 |
| 1.2.6.1 C1EIP启动子区域生物信息学分析 | 第99-100页 |
| 1.2.6.2 转录因子结合位点缺失的启动子报告基因载体的构建 | 第100页 |
| 1.2.6.3 转录因子结合位点缺失质粒的荧光素酶活性检测分析 | 第100页 |
| 1.2.7 鸡C1EIP基因核心启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化分析 | 第100-101页 |
| 1.2.7.1 5-Azadc、TSA和VPA对C1EIP启动子活性的诱导 | 第101页 |
| 1.2.7.2 5-Azadc、TSA和VAP对C1EIP在ESCs、SSCs和PGCs的表达分析 | 第101页 |
| 2 实验结果 | 第101-110页 |
| 2.1 鸡胚全基因组的提取 | 第101-102页 |
| 2.2 真核表达载体pC1EIP-EGFP的构建 | 第102页 |
| 2.3 C1EIP启动子活性定性分析 | 第102-103页 |
| 2.4 C1EIP启动子各缺失克隆载体和亚克隆载体的构建 | 第103-104页 |
| 2.5 C1EIP启动子活性分析 | 第104-105页 |
| 2.6 转录因子结合位点对C1EIP启动子活性的影响 | 第105-108页 |
| 2.7 C1EIP启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化分析 | 第108-109页 |
| 2.8 DNA甲基化和组蛋白乙酰化对C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表达变化的影响 | 第109-110页 |
| 3 讨论 | 第110-112页 |
| 4 本章小结 | 第112页 |
| 参考文献 | 第112-116页 |
| 第五章 C1EIP互作蛋白ENO1的筛查与鉴定 | 第116-132页 |
| 1 材料与方法 | 第116-122页 |
| 1.1 实验材料和试剂 | 第116-117页 |
| 1.1.1 实验材料和载体 | 第116页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第116-117页 |
| 1.2 实验方法 | 第117-122页 |
| 1.2.1 鸡C1EIP基因原核表达载体pET-49b-C1EIP的构建与鉴定 | 第117页 |
| 1.2.2 GST pull-down筛查C1EIP互作蛋白 | 第117-120页 |
| 1.2.3 融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA的构建与鉴定 | 第120页 |
| 1.2.4 融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA转染效果鉴定 | 第120-121页 |
| 1.2.5 转染细胞ENO1-HA融合基因RNA水平表达检测 | 第121页 |
| 1.2.6 转染细胞ENO1-HA融合蛋白水平表达检测 | 第121页 |
| 1.2.7 免疫共沉淀 | 第121-122页 |
| 2 实验结果 | 第122-128页 |
| 2.1 鸡C1EIP原核表达载体pET-49b-C1EIP的构建与鉴定 | 第122-123页 |
| 2.2 GST pull-down筛查C1EIP互作蛋白 | 第123页 |
| 2.3 融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA的构建与鉴定 | 第123-125页 |
| 2.4 融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA转染效果鉴定 | 第125-126页 |
| 2.5 转染细胞ENO1-HA融合基因转录水平表达检测 | 第126-127页 |
| 2.6 转染细胞ENO1-HA融合蛋白表达检测 | 第127-128页 |
| 2.7 免疫共沉淀 | 第128页 |
| 3 讨论 | 第128-130页 |
| 4 本章小结 | 第130页 |
| 参考文献 | 第130-132页 |
| 第六章 C1EIP与ENO1/MBP-1互作调控PGCs生成机制的初步探究 | 第132-149页 |
| 1 材料与方法 | 第132-136页 |
| 1.1 实验材料和试剂 | 第132-133页 |
| 1.1.1 实验材料和载体 | 第132页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第132-133页 |
| 1.2 实验方法 | 第133-136页 |
| 1.2.1 ENO1生物信息学分析 | 第133页 |
| 1.2.2 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 | 第133页 |
| 1.2.3 重组表达载体PGL3-Myc-pro的构建与鉴定 | 第133-134页 |
| 1.2.4 重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1与pcDNA3.0-ENO2载体的构建与鉴定 | 第134-135页 |
| 1.2.5 Myc启动子活性分析 | 第135-136页 |
| 1.2.6 绘制C1EIP与ENO1/MBP-1互作调控PGCs生成的作用模式图 | 第136页 |
| 2 实验结果 | 第136-144页 |
| 2.1 ENO1生物信息学分析 | 第136-137页 |
| 2.2 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 | 第137-140页 |
| 2.3 重组表达载体PGL3-Myc-pro的构建与鉴定 | 第140页 |
| 2.4 重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1与pcDNA3.0-ENO2载体的构建与鉴定 | 第140-142页 |
| 2.5 Myc启动子活性分析 | 第142-143页 |
| 2.6 绘制C1EIP与ENO1/MBP-1互作调控PGCs生成的作用模式图 | 第143-144页 |
| 3 讨论 | 第144-146页 |
| 4 本章小结 | 第146页 |
| 参考文献 | 第146-149页 |
| 第七章 全文结论和创新点 | 第149-151页 |
| 全本结论 | 第149-150页 |
| 全文创新点 | 第150-151页 |
| 附录 | 第151-154页 |
| 致谢 | 第154-156页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第156-158页 |
