| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第1章 绪论 | 第9-15页 |
| 1.1 昆虫抗性机制的研究进展 | 第10-11页 |
| 1.1.1 代谢抗性 | 第10-11页 |
| 1.1.2 靶标抗性 | 第11页 |
| 1.2 基因转染技术 | 第11-12页 |
| 1.3 RNA干扰 | 第12-14页 |
| 1.3.1 RNAi应用 | 第12-14页 |
| 1.3.1.1 在基因功能研究中的应用 | 第12-13页 |
| 1.3.1.2 在昆虫抗药性研究的应用 | 第13页 |
| 1.3.1.3 在害虫防治中的应用 | 第13-14页 |
| 1.4 泛素研究进展 | 第14-15页 |
| 第2章 溴氰菊酯胁迫对UB和L40基因表达水平的影响 | 第15-23页 |
| 2.1 实验材料 | 第15页 |
| 2.1.1 果蝇细胞 | 第15页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第15页 |
| 2.1.3 主要耗材和仪器 | 第15页 |
| 2.2 实验方法 | 第15-19页 |
| 2.2.1 UB和L40对溴氰菊酯的响应 | 第15-19页 |
| 2.2.1.1 细胞传代培养 | 第15-16页 |
| 2.2.1.2 不同浓度的溴氰菊酯诱导果蝇细胞 | 第16页 |
| 2.2.1.3 提取果蝇总RNA | 第16-17页 |
| 2.2.1.4 检测RNA浓度和纯度 | 第17页 |
| 2.2.1.5 UB和L40基因的反转录和荧光定量 | 第17-19页 |
| 2.2.1.6 同一浓度的溴氰菊酯诱导果蝇细胞不同时间 | 第19页 |
| 2.2.1.7 RNA提取,反转录与荧光定量 | 第19页 |
| 2.3 结果 | 第19-22页 |
| 2.3.1 UB和L40在不同浓度药物刺激下表达量变化 | 第19-20页 |
| 2.3.2 UB和L40在药物刺激不同时间下表达量变化 | 第20-22页 |
| 2.4 讨论 | 第22-23页 |
| 第3章 UB和L40的表达水平对Kc细胞抗性的影响 | 第23-42页 |
| 3.1 实验材料 | 第23页 |
| 3.1.1 果蝇Kc细胞 | 第23页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第23页 |
| 3.1.3 主要耗材和仪器 | 第23页 |
| 3.2 实验方法 | 第23-36页 |
| 3.2.1 UB和L40转染果蝇Kc细胞 | 第23-28页 |
| 3.2.1.1 UB和L40基因全长的扩增 | 第23-25页 |
| 3.2.1.2 PCR产物纯化与测序 | 第25-26页 |
| 3.2.1.3 构建昆虫表达载体 | 第26-27页 |
| 3.2.1.4 目的基因的Kc细胞转染 | 第27-28页 |
| 3.2.2 鉴定重组质粒的表达 | 第28-33页 |
| 3.2.2.1 基因水平重组质粒的表达鉴定 | 第28-29页 |
| 3.2.2.2 蛋白质水平重组质粒的表达鉴定 | 第29-33页 |
| 3.2.3 UB和L40基因的干扰 | 第33-35页 |
| 3.2.3.1 RNA的提取和反转录 | 第33页 |
| 3.2.3.2 制备dsRNA | 第33-35页 |
| 3.2.3.3 UB或L40基因干扰 | 第35页 |
| 3.2.4 干扰效率的的检测 | 第35页 |
| 3.2.4.1 基因水平干扰效率的检测 | 第35页 |
| 3.2.4.2 蛋白质水平重组质粒的表达鉴定 | 第35页 |
| 3.2.5 细胞毒性检测 | 第35-36页 |
| 3.3 实验结果 | 第36-41页 |
| 3.3.1 细胞转染UB和L40后基因水平表达量变化 | 第36-37页 |
| 3.3.2 细胞干扰UB和L40后基因水平表达量变化 | 第37-38页 |
| 3.3.3 细胞转染UB和L40后蛋白质水平表达量变化 | 第38页 |
| 3.3.4 细胞干扰UB和L40后蛋白质水平表达量变化 | 第38-39页 |
| 3.3.5 转染后果蝇细胞抗溴氰菊酯水平检测 | 第39页 |
| 3.3.6 干扰后果蝇细胞抗溴氰菊酯水平检测 | 第39-41页 |
| 3.4 讨论 | 第41-42页 |
| 第4章 小菜蛾幼虫UB和L40基因的RNAi效应 | 第42-53页 |
| 4.1 实验材料 | 第42页 |
| 4.1.1 供试小菜蛾 | 第42页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 4.1.3 主要耗材和仪器 | 第42页 |
| 4.2 实验方法 | 第42-48页 |
| 4.2.1 总RNA的提取及模板的合成 | 第42-43页 |
| 4.2.1.1 幼虫RNA的提取 | 第42-43页 |
| 4.2.1.2 RNA浓度和纯度测定 | 第43页 |
| 4.2.1.3 反转录 | 第43页 |
| 4.2.2 dsRNA引物及定量引物的设计 | 第43-44页 |
| 4.2.3 克隆dsRNA靶标序列 | 第44-45页 |
| 4.2.4 PET-2P-GFP表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 4.2.4.1 T4连接反应 | 第45页 |
| 4.2.4.2 质粒克隆 | 第45页 |
| 4.2.4.3 目的条带的检测和质粒提取 | 第45-46页 |
| 4.2.5 转化HT115大肠杆菌细胞 | 第46页 |
| 4.2.6 载体表达dsRNA的验证 | 第46-47页 |
| 4.2.6.1 总核酸提取检测 | 第46-47页 |
| 4.2.6.2 RNase A处理检测 | 第47页 |
| 4.2.7 小菜蛾喂食dsRNA | 第47页 |
| 4.2.8 荧光定量PCR反应 | 第47页 |
| 4.2.9 数据统计方法 | 第47页 |
| 4.2.10 毒力测定方法 | 第47-48页 |
| 4.3 实验结果 | 第48-51页 |
| 4.3.1 RNA干扰靶标片段的克隆 | 第48页 |
| 4.3.2 dsRNA载体的构建和酶切 | 第48-49页 |
| 4.3.3 载体表达dsRNA的验证 | 第49-50页 |
| 4.3.4 喂食表达UB和L40的dsRNA菌液对靶标基因的影响 | 第50页 |
| 4.3.5 UB或L40干扰后小菜蛾对溴氰菊酯敏感性的变化 | 第50-51页 |
| 4.4 讨论 | 第51-53页 |
| 第5章 总结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 在读学位期间的研究成果 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
