| 致谢 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-22页 |
| 1 文献综述 | 第13-20页 |
| ·植物bHLH类转录因子研究进展 | 第13-16页 |
| ·bHLH转录因子结构特点及植物bHLH转录因子家族 | 第13-14页 |
| ·bHLH转录因子的功能多样性 | 第14-16页 |
| ·展望 | 第16页 |
| ·非生物性逆境胁迫对植物的影响 | 第16-17页 |
| ·干旱对植物的影响 | 第16页 |
| ·盐胁迫对植物的影响 | 第16-17页 |
| ·重金属对植物的影响 | 第17页 |
| ·展望 | 第17页 |
| ·植物体内锰的调控 | 第17-19页 |
| ·Mn~(2+)在细胞内积累的机制 | 第17-18页 |
| ·Mn~(2+)积累到内膜区室的机制 | 第18-19页 |
| ·Mn~(2+)运输的机制 | 第19页 |
| ·关于Mn~(2+)专一性的分子决定因素的确定 | 第19页 |
| ·展望 | 第19页 |
| ·酵母单杂系统 | 第19-20页 |
| 2 引言 | 第20-21页 |
| 3 技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 B695基因克隆、序列分析及亚细胞定位 | 第22-36页 |
| 1 材料 | 第22-24页 |
| ·植物材料 | 第22页 |
| ·菌株和载体 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| ·培养基和溶液试剂的配制 | 第22-24页 |
| ·引物序列 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-30页 |
| ·植物材料培养 | 第24页 |
| ·自交系昌7-2的培养 | 第24页 |
| ·珊西烟的培养 | 第24页 |
| ·植物全基因组RNA的提取 | 第24-25页 |
| ·植物全基因组RNA的纯化 | 第25页 |
| ·RNA纯化后电泳检测和浓度测定 | 第25页 |
| ·电泳检测RNA的完整性 | 第25页 |
| ·RNA纯度检测 | 第25页 |
| ·RNA的反转 | 第25-26页 |
| ·B695目的基因获得 | 第26页 |
| ·切胶回收基因片段 | 第26-27页 |
| ·T载体连接及转化大肠杆菌 | 第27-28页 |
| ·基因片段连接到T载体 | 第27页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH1OB | 第27-28页 |
| ·B695基因测序及序列分析 | 第28页 |
| ·基本性质分析 | 第28页 |
| ·同源性分析和功能预测 | 第28页 |
| ·玉米中B695基因组织特异性的表达分析 | 第28页 |
| ·质粒提取 | 第28页 |
| ·B695亚细胞定位 | 第28-30页 |
| ·B695亚细胞定位载体构建 | 第28-29页 |
| ·农杆菌转化 | 第29页 |
| ·农杆菌介导法转化珊西烟 | 第29-30页 |
| ·洋葱表皮瞬时转化 | 第30页 |
| ·荧光显微镜观察 | 第30页 |
| 3 结果与分析 | 第30-34页 |
| ·B695目的基因获得 | 第30-31页 |
| ·昌7-2玉米总RNA提取与检测 | 第30-31页 |
| ·玉米B695基因全长克隆 | 第31页 |
| ·B695基因片段的序列分析 | 第31页 |
| ·玉米中B695组织特异性表达情况 | 第31-32页 |
| ·植物亚细胞定位载体的构建 | 第32-33页 |
| ·pEGAD-B695融合表达载体构建 | 第32页 |
| ·农杆菌转化结果 | 第32-33页 |
| ·荧光显微镜观察B695蛋白亚细胞定位 | 第33-34页 |
| 4 小结与讨论 | 第34-36页 |
| ·小结 | 第34页 |
| ·讨论 | 第34-36页 |
| 第三章 B695原核表达及抗体制备 | 第36-48页 |
| 1 材料 | 第36-39页 |
| ·菌种和载体 | 第36页 |
| ·试剂 | 第36页 |
| ·培养基和溶液的配制 | 第36-39页 |
| ·载体构建 | 第36页 |
| ·蛋白诱导表达及检测 | 第36-38页 |
| ·Elisa检测 | 第38-39页 |
| ·引物 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-43页 |
| ·B695原核表达载体构建 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pET30a-B695转化表达菌株BL21(DE3)PLysS | 第40页 |
| ·制备BL21(DE3)PLysS感受态细胞 | 第40页 |
| ·质粒pET30a-B695热激法转化BL21(DE3)PLysS | 第40页 |
| ·菌落PCR检测 | 第40页 |
| ·蛋白诱导表达 | 第40-42页 |
| ·IPTG诱导蛋白表达 | 第40页 |
| ·SDS-PAGE | 第40-42页 |
| ·western-blot检测 | 第42页 |
| ·蛋白回收 | 第42-43页 |
| ·免疫及抗体纯化流程 | 第43页 |
| ·Elisa检测流程 | 第43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-46页 |
| ·pET30a-B695原核表达载体构建 | 第43-44页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)PLysS转化结果 | 第44页 |
| ·B695蛋白与组氨酸标签的融合表达 | 第44-45页 |
| ·Western-blot检测 | 第45页 |
| ·抗体制备及检测 | 第45-46页 |
| 4 小结与讨论 | 第46-48页 |
| ·小结 | 第46-47页 |
| ·讨论 | 第47-48页 |
| 第四章 转录活性分析 | 第48-58页 |
| 1 材料 | 第48-50页 |
| ·酵母菌株和载体 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48页 |
| ·溶液的配制 | 第48-50页 |
| ·引物序列 | 第50页 |
| 2 方法 | 第50-52页 |
| ·目的基因获得 | 第50页 |
| ·重组质粒pGBKT7-B695、pGBKT7-B695-N、pGBKT7-B695-N+HLH转化酵母 | 第50-52页 |
| ·酵母感受态细胞制备 | 第50页 |
| ·PEG/LiAC法转化酵母细胞 | 第50-51页 |
| ·酵母菌落PCR鉴定 | 第51-52页 |
| ·阳性克隆的显色反应(β-galactosidase filter assays) | 第52页 |
| ·X-a-gal染色 | 第52页 |
| ·SD/-Try/-His液体培养生长实验 | 第52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-56页 |
| ·B695转录激活相关载体构建 | 第52-54页 |
| ·酵母AH109转化结果 | 第54-55页 |
| ·B695转录激活域的确定 | 第55-56页 |
| 4 小结与讨论 | 第56-58页 |
| ·小结 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-58页 |
| 第五章 B695对胁迫环境的应激反应初步分析 | 第58-75页 |
| 1 材料 | 第58-61页 |
| ·植物材料 | 第58页 |
| ·菌株和载体 | 第58页 |
| ·试剂 | 第58-59页 |
| ·培养基和溶液试剂的配制 | 第59-61页 |
| ·SD/-Trp固体培养基配制 | 第59页 |
| ·/2 MS固体培养基配制 | 第59页 |
| ·Fe~(2+)SD/-Trp和MS培养基配制 | 第59页 |
| ·Mn~(2+)SD/-Trp和MS培养基配制 | 第59页 |
| ·Cu~(2+)SD/-Trp和MS培养基配制 | 第59-60页 |
| ·Zn~(2+)SD/-Trp和MS培养基配制 | 第60页 |
| ·Cd~(2+)SD/-Trp培养基配制 | 第60页 |
| ·NaCl SD/-Trp和MS培养基配制 | 第60页 |
| ·PEG6000 SD/-Trp和MS培养基配制 | 第60-61页 |
| ·甘露醇SD/-Trp培养基配制 | 第61页 |
| ·植物组织蛋白质提取 | 第61页 |
| ·其余实验试剂配制方法 | 第61页 |
| ·引物序列 | 第61页 |
| 2 方法 | 第61-64页 |
| ·胁迫处理酵母菌株AH109-pGBK-B695 | 第61页 |
| ·植物材料培育 | 第61-62页 |
| ·玉米的培育 | 第61-62页 |
| ·珊西烟的培育 | 第62页 |
| ·玉米全基因组RNA的提取与纯化及cDNA的获得 | 第62页 |
| ·割胶回收基因片段及T载体连接 | 第62页 |
| ·玉米杂交种抗锰胁迫筛选 | 第62页 |
| ·铁锰铜锌金属胁迫处理郑单958幼苗 | 第62页 |
| ·B695植物过量表达载体构建 | 第62-63页 |
| ·质粒提取 | 第63页 |
| ·农杆菌转化 | 第63页 |
| ·B695转基因烟草分子检测 | 第63页 |
| ·Real-time PCR | 第63页 |
| ·植物组织蛋白质提取方法(TCA-丙酮法) | 第63-64页 |
| ·SDS-PAGE及western blot检测 | 第64页 |
| ·B695转基因烟草逆境胁迫处理 | 第64页 |
| 3 结果与分析 | 第64-74页 |
| ·酵母生长实验结果 | 第64-65页 |
| ·玉米杂交种抗锰胁迫筛选结果 | 第65-66页 |
| ·玉米中B695在铁锰铜锌处理下的表达谱 | 第66页 |
| ·B695转基因烟草分子鉴定 | 第66-68页 |
| ·B695过量表达转基因烟草的初步抗性分析结果 | 第68-74页 |
| 4 小结与讨论 | 第74-75页 |
| ·小结 | 第74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| 第六章 B695响应锰胁迫机制的初步分析 | 第75-90页 |
| 1 材料 | 第75-77页 |
| ·植物材料 | 第75页 |
| ·试剂 | 第75页 |
| ·培养基和溶液试剂的配制 | 第75-76页 |
| ·Mn~(2+)MS培养基配制 | 第75页 |
| ·植物组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂 | 第75-76页 |
| ·植物组织中抗坏血酸过氧化物酶(APX)含量测定试剂 | 第76页 |
| ·植物组织中过氧化物酶(POD)含量测定试剂 | 第76页 |
| ·植物组织中过氧化氢酶(CAT)活性测定试剂 | 第76页 |
| ·NBT和DAB染色液 | 第76页 |
| ·引物序列 | 第76-77页 |
| 2 方法 | 第77-79页 |
| ·烟草的培养 | 第77页 |
| ·烟草幼苗活性氧染色 | 第77-78页 |
| ·测定烟草幼苗体内铁锰含量 | 第78页 |
| ·叶绿素含量测定 | 第78页 |
| ·各项生理指标测定 | 第78-79页 |
| ·SOD活性测定 | 第78页 |
| ·CAT活性测定 | 第78页 |
| ·APX活性测定 | 第78页 |
| ·POD活性测定 | 第78-79页 |
| ·锰金属胁迫处理烟草基因调控 | 第79页 |
| ·短时间锰胁迫烟草幼苗 | 第79页 |
| 3 结果与分析 | 第79-88页 |
| ·B695对锰胁迫下活性氧积累的影响 | 第79-81页 |
| ·B695对锰胁迫下活性氧清除相关酶活性测定及其编码基因表达的影响 | 第81-83页 |
| ·B695对锰胁迫下相关基因的表达的影响 | 第83-84页 |
| ·B695对锰胁迫下体内铁锰含量及叶绿素含量的影响 | 第84-85页 |
| ·B695对短时期锰胁迫下活性氧积累的影响 | 第85-88页 |
| 4 小结与讨论 | 第88-90页 |
| ·小结 | 第88页 |
| ·讨论 | 第88-90页 |
| 第七章 结论 | 第90-92页 |
| 1 结论 | 第90-91页 |
| 2 展望 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-98页 |
| 英文摘要 | 第98-99页 |
