| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 缩略语 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-18页 |
| 1. 动物肝脏再生功能的研究进展 | 第11页 |
| 2. 鲨鱼再生肝的研究进展 | 第11-12页 |
| 3. TBC 蛋白的研究进展 | 第12-13页 |
| ·TBC 蛋白简介 | 第12-13页 |
| ·TBC1D15 蛋白研究进展 | 第13页 |
| 4. 结构生物学技术的研究进展 | 第13-16页 |
| ·结构生物学 | 第13-14页 |
| ·结构生物学的主要研究方法 | 第14-16页 |
| ·X 射线单晶衍射技术 | 第14-15页 |
| ·核磁共振技术(NMR) | 第15页 |
| ·电子显微学方法 | 第15-16页 |
| 5.AlphaScreen 的原理和优点 | 第16-18页 |
| 第二章 实验方案 | 第18-20页 |
| 1. 实验目的及意义 | 第18页 |
| 2. 实验内容 | 第18-19页 |
| 3. 实验流程图 | 第19-20页 |
| 第三章 重组 APSL 的表达及结晶条件筛选 | 第20-35页 |
| 1. 材料、试剂与设备仪器 | 第20-23页 |
| ·材料 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20页 |
| ·仪器设备 | 第20-21页 |
| ·实验试剂配制 | 第21-23页 |
| 2. 方法 | 第23-27页 |
| ·APSL 基因的引物设计 | 第23页 |
| ·APSL 基因的 PCR 扩增 | 第23-24页 |
| ·PCR 扩增产物和载体的双酶切并纯化 | 第24-25页 |
| ·连接反应 | 第25页 |
| ·用 CaCl2法制备 E.coli Top10 、E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第25页 |
| ·连接产物的转化 | 第25-26页 |
| ·重组质粒提取与鉴定 | 第26页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第26页 |
| ·重组载体 pETduet-His-Sumo-APSL 和 pETduet-MBP-APSL 转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第26页 |
| ·融合蛋白 His-Sumo-APSL 在大肠杆菌中的原核表达纯化 | 第26-27页 |
| ·融合蛋白 MBP-APSL 在大肠杆菌中的原核表达纯化 | 第27页 |
| ·蛋白凝胶电泳检测 | 第27页 |
| ·ULP1 切割纯化后的重组融合蛋白 His-Sumo-APSL | 第27页 |
| ·凝胶层析纯化 APSL 蛋白和 MBP-APSL 融合蛋白 | 第27页 |
| 3 重组 APSL 的结晶探索 | 第27-28页 |
| ·Phoenix Robot 点晶机器人点晶 | 第27页 |
| ·RockImager 观察 | 第27-28页 |
| 4 实验结果 | 第28-34页 |
| ·PCR 扩增目的片段的检测 | 第28页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第28-29页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第29-32页 |
| ·融合蛋白 His-Sumo-APSL 的原核表达 | 第29-31页 |
| ·融合蛋白 MBP-APSL 的原核表达 | 第31-32页 |
| ·APSL 结晶条件筛选结果 | 第32-34页 |
| 5. 讨论 | 第34-35页 |
| 第四章 鲨鱼肝脏部分切除再生模型的建立及 APSL 基因全序列的获得与确定 | 第35-42页 |
| 1. 鲨鱼再生肝模型的建立 | 第35-36页 |
| ·材料与试剂 | 第35页 |
| ·材料 | 第35页 |
| ·试剂 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-36页 |
| ·鲨鱼饲养 | 第35页 |
| ·鲨鱼肝脏 1/3 部分切除再生模型建立 | 第35-36页 |
| ·鲨鱼再生肝 cDNA 文库的建立 | 第36页 |
| 2.APSL 全基因序列的获得 | 第36页 |
| ·APSL 基因序列放入鲨鱼再生肝脏 cDNA 文库中比对 | 第36页 |
| ·APSL 全基因序列分析 | 第36页 |
| 3. 结果 | 第36-41页 |
| ·APSL 全基因序列获得 | 第36-37页 |
| ·APSL 全基因序列分析 | 第37-41页 |
| ·一级结构分析 | 第37-38页 |
| ·疏水性分析 | 第38页 |
| ·跨膜区和信号肽分析 | 第38-39页 |
| ·功能位点分析 | 第39-40页 |
| ·APSL 全氨基酸序列同源性分析 | 第40-41页 |
| 4. 讨论 | 第41-42页 |
| 第五章 TBC1D15 蛋白的表达纯化 | 第42-66页 |
| 1. 材料、试剂与设备仪器 | 第42-46页 |
| ·材料 | 第42页 |
| ·TBC1D15 基因的获得 | 第42页 |
| ·试剂 | 第42-43页 |
| ·仪器设备 | 第43页 |
| ·实验试剂配制 | 第43-46页 |
| 2.方法 | 第46-54页 |
| ·TBC1D15 蛋白的原核表达纯化 | 第46-49页 |
| ·TBC1D15 各基因双酶切并纯化 | 第46页 |
| ·载体的双酶切并纯化 | 第46-47页 |
| ·连接反应 | 第47页 |
| ·连接产物的转化 | 第47页 |
| ·重组质粒提取与鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第48页 |
| ·重组质粒转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第48页 |
| ·Beads binding 检测重组质粒在大肠杆菌中的表达情况 | 第48-49页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的原核表达纯化 | 第49页 |
| ·ULP1 切割纯化后的重组融合蛋白 | 第49页 |
| ·凝胶层析获得纯净 TBC1D15 蛋白 | 第49页 |
| ·TBC1D15 蛋白的昆虫表达系统表达纯化 | 第49-54页 |
| ·载体 pfastbac–H8MBP-TEV 的双酶切回收 | 第49-50页 |
| ·连接反应 | 第50页 |
| ·连接产物的转化 | 第50页 |
| ·重组质粒的提取与鉴定 | 第50页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第50页 |
| ·E.coli DH10Bac 感受态细胞制备 | 第50-51页 |
| ·重组质粒转化 E.coli DH10Bac 感受态细胞 | 第51页 |
| ·重组 Bacmid 的提取 | 第51页 |
| ·重组 Bacmid 的 PCR 鉴定 | 第51-52页 |
| ·昆虫细胞 SF9 细胞悬浮培养 | 第52页 |
| ·细胞冻存 | 第52-53页 |
| ·细胞复苏 | 第53页 |
| ·脂质体介导法转染昆虫 SF9 细胞 | 第53页 |
| ·重组病毒获取 | 第53页 |
| ·融合蛋白 H8MBP-TEV-TBC1D15 的表达纯化 | 第53-54页 |
| ·TEV 酶切割融合蛋白 | 第54页 |
| ·凝胶层析获得纯净 TBC1D15 蛋白 | 第54页 |
| 3. 重组 TBC1D15 蛋白的结晶探索 | 第54页 |
| 4. 实验结果 | 第54-65页 |
| ·原核表达结果 | 第54-59页 |
| ·TBC1D15 基因的获得 | 第54-55页 |
| ·重组质粒 pETduet-His-Sumo-TBC1D15 双酶切鉴定 | 第55-56页 |
| ·TBC1D15 蛋白原核表达纯化结果 | 第56-59页 |
| ·真核表达结果 | 第59-64页 |
| ·重组质粒 pfastbac-H8-OMBP-TEV-TBC1D15 双酶切鉴定 | 第59-60页 |
| ·重组 Bacmid 的 PCR 鉴定 | 第60页 |
| ·TBC1D15 蛋白真核表达纯化结果 | 第60-64页 |
| ·TBC1D15 蛋白晶体条件筛选 | 第64-65页 |
| 5. 讨论 | 第65-66页 |
| 第六章 Rab7a 蛋白的表达纯化 | 第66-76页 |
| 1. 材料、试剂与设备仪器 | 第66-68页 |
| ·材料 | 第66页 |
| ·Rab7a 基因的获得 | 第66页 |
| ·试剂 | 第66-67页 |
| ·仪器设备 | 第67页 |
| ·实验试剂配制 | 第67-68页 |
| 2. 方法 | 第68-72页 |
| ·Rab7a 基因的引物设计 | 第68-69页 |
| ·Rab7a 基因的 PCR 扩增 | 第69-70页 |
| ·PCR 产物转化 E.coli TOP10 感受态细胞 | 第70页 |
| ·目的基因的测序鉴定 | 第70页 |
| ·双酶切并纯化获得目的基因和载体 | 第70页 |
| ·连接反应 | 第70页 |
| ·连接产物的转化 | 第70-71页 |
| ·重组质粒提取与鉴定 | 第71页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第71页 |
| ·重组载体转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第71页 |
| ·融合蛋白 Biotin-MBP-Rab7a-wt/Q67L/T22N 在大肠杆菌中的原核表达纯化 | 第71-72页 |
| ·蛋白凝胶电泳检测 | 第72页 |
| 3. 实验结果 | 第72-75页 |
| ·重组质粒 pETduet-biotin-mbp-Rab7a-wt/Q67L/T22N 双酶切鉴定 | 第72页 |
| ·融合蛋白 Biotin-mbp-Rab7a-wt/Q67L/T22N 表达纯化结果 | 第72-75页 |
| 4. 讨论 | 第75-76页 |
| 第七章 TBC1D15 体外活性实验 | 第76-81页 |
| 1. 实验试剂、材料与仪器设备 | 第76页 |
| ·实验材料 | 第76页 |
| ·实验试剂 | 第76页 |
| ·实验仪器 | 第76页 |
| ·10× AlphaScreen buffer 配制 | 第76页 |
| 2. 方法 | 第76-77页 |
| 3. 实验结果 | 第77-80页 |
| 4. 讨论 | 第80-81页 |
| 结果 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
