| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 英文缩略词表(ABBREVIATION) | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-37页 |
| 1 前言 | 第19-20页 |
| 2 胚胎干细胞的概念与特性 | 第20-21页 |
| ·胚胎干细胞的概念 | 第20页 |
| ·胚胎干细胞的生物学特性 | 第20-21页 |
| 3 胚胎干细胞的研究进展 | 第21-29页 |
| ·各种动物胚胎干细胞的分离培养概况 | 第21-22页 |
| ·胚胎干细胞的分离培养体系 | 第22-24页 |
| ·饲养层为基础的培养体系 | 第22页 |
| ·无饲养层培养体系 | 第22-23页 |
| ·无血清培养体系 | 第23-24页 |
| ·无血清、无饲养层培养体系 | 第24页 |
| ·胚胎干细胞体外分化的研究进展 | 第24-29页 |
| ·胚胎干细胞体外分化的基本途径 | 第24页 |
| ·胚胎干细胞体外可分化为多种类型细胞 | 第24-27页 |
| ·胚胎干细胞来源的分化细胞的体内移植研究 | 第27-29页 |
| ·胚胎干细胞研究在动物遗传育种与繁殖领域的应用 | 第29页 |
| 4 动物乳腺生物反应器的研究进展 | 第29-32页 |
| ·动物乳腺生物反应器的概念 | 第29-30页 |
| ·动物乳腺生物反应器的表达载体的发展 | 第30-31页 |
| ·基于普通质粒的表达载体 | 第30页 |
| ·基于酵母人工染色体的表达载体 | 第30-31页 |
| ·基于同源重组的定点打靶载体 | 第31页 |
| ·动物乳腺生物反应器的发展现状 | 第31-32页 |
| 5 猪β防御素研究进展 | 第32-35页 |
| ·猪β防御素的分布、分子结构与抗菌机制 | 第33-34页 |
| ·猪β防御素的克隆和表达 | 第34-35页 |
| 6 本研究的目的和意义 | 第35-37页 |
| 第二章 昆明白小鼠类胚胎干细胞的分离、培养及生物学特性 | 第37-51页 |
| 1 引言 | 第37页 |
| 2 试验材料 | 第37-40页 |
| ·试验动物 | 第37页 |
| ·主要试剂 | 第37-38页 |
| ·主要仪器 | 第38页 |
| ·主要试剂的配制 | 第38-40页 |
| 3 试验方法 | 第40-45页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞的分离与培养 | 第40-41页 |
| ·饲养层细胞的制备 | 第40页 |
| ·昆明白小鼠的超排处理及胚胎的收集 | 第40-41页 |
| ·昆明白小鼠胚胎的培养及类ES细胞的分离 | 第41页 |
| ·小鼠类ES细胞的鉴定 | 第41-45页 |
| ·形态学观察 | 第41页 |
| ·RT-PCR检测 | 第41-43页 |
| ·免疫细胞化学染色鉴定 | 第43-44页 |
| ·小鼠类ES细胞的冻存 | 第44页 |
| ·小鼠类ES细胞的的复苏 | 第44页 |
| ·核型分析 | 第44-45页 |
| ·体内分化 | 第45页 |
| ·体外分化 | 第45页 |
| 4 结果与分析 | 第45-49页 |
| ·昆明白小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养 | 第45页 |
| ·昆明白小鼠胚胎的收集与培养 | 第45-47页 |
| ·形态鉴定 | 第47页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞的特异标记基因的检测 | 第47页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞的免疫细胞化学染色鉴定 | 第47-48页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞的核型分析 | 第48页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞的体内分化能力 | 第48页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞的体外分化 | 第48-49页 |
| 5 讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 昆明白小鼠类ES细胞体外定向分化为上皮样细胞的研究 | 第51-67页 |
| 1 引言 | 第51-52页 |
| 2 试验材料 | 第52-53页 |
| ·试验动物 | 第52页 |
| ·主要试剂 | 第52-53页 |
| ·主要仪器 | 第53页 |
| ·主要试剂的配制 | 第53页 |
| 3 试验方法 | 第53-58页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞体外分化为上皮样细胞的培养体系 | 第53页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞来源的上皮样细胞系的鉴定 | 第53-58页 |
| ·形态学观察 | 第53页 |
| ·RT-PCR检测 | 第53-57页 |
| ·免疫细胞化学染色鉴定 | 第57页 |
| ·流式细胞检测 | 第57-58页 |
| ·细胞生长曲线 | 第58页 |
| ·细胞核型分析 | 第58页 |
| 4 结果与分析 | 第58-63页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞体外分化为上皮样细胞 | 第58-60页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞来源的上皮样细胞的特异标记基因的检测 | 第60页 |
| ·昆明白小鼠类ES细胞来源的上皮样分化细胞的免疫细胞化学染色鉴定 | 第60-62页 |
| ·细胞生长曲线 | 第62-63页 |
| ·细胞核型分析 | 第63页 |
| 5 讨论 | 第63-67页 |
| ·ES细胞向上皮样细胞的分化 | 第63-64页 |
| ·ES细胞来源的上皮样分化细胞的鉴定 | 第64-65页 |
| ·ES细胞来源的上皮样细胞的应用前景 | 第65-67页 |
| 第四章 猪β防御素-1乳腺特异性表达载体的构建 | 第67-87页 |
| 1 引言 | 第67页 |
| 2 试验材料 | 第67-71页 |
| ·试验动物 | 第67-68页 |
| ·质粒、菌株和细胞株 | 第68-69页 |
| ·主要药品及试剂 | 第69页 |
| ·常用试剂配方 | 第69-70页 |
| ·主要仪器 | 第70-71页 |
| 3 试验方法 | 第71-79页 |
| ·猪肝脏组织总RNA的提取和cDNA第一链的合成 | 第71-72页 |
| ·组织总RNA的提取 | 第71页 |
| ·RNA完整性的检测 | 第71页 |
| ·组织总RNA的RNase-free DNase-I处理及纯化 | 第71-72页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第72页 |
| ·PCR扩增PBD-1基因 | 第72-73页 |
| ·引物设计与合成 | 第72页 |
| ·RT-PCR反应 | 第72页 |
| ·RT-PCR反应产物的检测 | 第72-73页 |
| ·目的片段的回收、克隆、鉴定和序列测定 | 第73-75页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第73页 |
| ·载体连接 | 第73页 |
| ·连接产物的转化 | 第73-74页 |
| ·阳性克隆子的PCR鉴定和测序 | 第74页 |
| ·质粒的提取及酶切鉴定 | 第74-75页 |
| ·序列测定 | 第75页 |
| ·cDNA序列的生物信息学分析 | 第75页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第75-77页 |
| ·构建方法 | 第75页 |
| ·连接产物的双酶切反应体系 | 第75-76页 |
| ·载体的双酶切反应体系 | 第76页 |
| ·酶切产物的连接 | 第76页 |
| ·重组体转化大肠杆菌DH5α | 第76-77页 |
| ·含重组质粒的细菌菌落的筛选和鉴定 | 第77页 |
| ·乳腺特异表达载体的构建 | 第77-79页 |
| ·引物设计与合成 | 第77页 |
| ·PCR扩增BLG片段 | 第77-78页 |
| ·质粒pIRES2-EGFP-PBD-1双酶切及目的片段的回收 | 第78页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1乳腺特异性表达载体的构建 | 第78页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1乳腺特异性表达载体的酶切鉴定 | 第78页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1乳腺特异性表达载体的PCR鉴定 | 第78页 |
| ·含pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1质粒的细菌培养物的保存 | 第78-79页 |
| 4 结果与分析 | 第79-84页 |
| ·猪PBD-1基因的分离 | 第79-81页 |
| ·猪肝脏组织总RNA的提取 | 第79页 |
| ·猪PBD-1基因的PCR扩增及测序 | 第79-80页 |
| ·猪PBD-1基因cDNA序列的生物信息学分析 | 第80-81页 |
| ·猪PBD-1基因真核表达载体的构建 | 第81-82页 |
| ·猪PBD-1基因山羊乳腺特异性表达载体的构建 | 第82-84页 |
| 5 讨论 | 第84-87页 |
| ·关于猪β防御素-1 | 第84-85页 |
| ·关于动物乳腺特异性表达载体的构建 | 第85-86页 |
| ·关于pIRES2-EGFP载体 | 第86-87页 |
| 第五章 转基因前体/干细胞移植策略快速建立动物乳腺生物反应器模型的研究 | 第87-110页 |
| 1 引言 | 第87-88页 |
| 2 试验材料 | 第88-89页 |
| ·细胞 | 第88页 |
| ·试验动物 | 第88页 |
| ·主要试剂 | 第88-89页 |
| ·主要仪器 | 第89页 |
| ·主要试剂的配制 | 第89页 |
| 3 试验方法 | 第89-99页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1质粒的大量提取、纯化及鉴定 | 第89-90页 |
| ·含pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的细菌培养物的复苏 | 第89-90页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1质粒的大量提取及纯化 | 第90页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1质粒的鉴定 | 第90页 |
| ·pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1质粒纯度及浓度的测定 | 第90页 |
| ·细胞转染 | 第90-91页 |
| ·稳定转染细胞的鉴定 | 第91-93页 |
| ·形态观察 | 第91页 |
| ·PCR鉴定目的基因及特异基因的表达 | 第91-92页 |
| ·免疫细胞化学鉴定 | 第92-93页 |
| ·试验动物分组及细胞移植 | 第93-94页 |
| ·试验动物及分组 | 第93页 |
| ·细胞移植 | 第93-94页 |
| ·移植细胞在宿主乳腺组织中的生存及整合 | 第94-95页 |
| ·乳腺组织提取总RNA，检测目的基因PBD-1 | 第94页 |
| ·乳腺组织冰冻切片的制备 | 第94页 |
| ·免疫组化检测 | 第94页 |
| ·苏木素-伊红染色(HE染色) | 第94-95页 |
| ·乳汁的采集及处理 | 第95-96页 |
| ·ELISA检测乳汁中PBD-1蛋白的表达 | 第96-97页 |
| ·试剂的准备 | 第96页 |
| ·操作步骤 | 第96-97页 |
| ·试验方案 | 第97页 |
| ·试剂盒性能 | 第97页 |
| ·结果判断与分析 | 第97页 |
| ·Western blotting检测乳汁中PBD-1蛋白的表达 | 第97-99页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第97-98页 |
| ·Western blotting鉴定 | 第98-99页 |
| 4 结果与分析 | 第99-105页 |
| ·细胞的稳定转染 | 第99页 |
| ·稳定转染细胞的鉴定 | 第99-101页 |
| ·移植细胞在宿主乳腺组织中的生存及整合 | 第101-103页 |
| ·ELISA检测乳汁中PBD-1蛋白的表达情况 | 第103-104页 |
| ·乳汁表达产物的Western blotting分析 | 第104-105页 |
| 5 讨论 | 第105-110页 |
| ·关于外源基因的稳定导入 | 第105-106页 |
| ·干细胞体内移植有效标记:增强型绿色荧光蛋白 | 第106-107页 |
| ·转基因前体/干细胞移植技术的应用 | 第107-110页 |
| 下一步的工作 | 第110-111页 |
| 小结 | 第111-112页 |
| 主要创新点 | 第112-113页 |
| 主要参考文献 | 第113-131页 |
| 附录1:本研究获取的山羊BLG基因序列 | 第131页 |
| 附录2:猪PBD-1基因cDNA的测序结果 | 第131-132页 |
| 在读期间发表及待发表论文(摘要、专利)题录 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
