| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 英文缩写表 | 第14-16页 |
| 1 文献综述 | 第16-28页 |
| 引言 | 第16页 |
| ·副溶血弧菌 | 第16-19页 |
| ·副溶血弧菌的起源及其生物学特性 | 第16-17页 |
| ·副溶血弧菌的分布及危害 | 第17-18页 |
| ·副溶血弧菌的致病机制 | 第18-19页 |
| ·三型分泌系统 | 第19-23页 |
| ·三型分泌系统的作用机制和构成 | 第19-20页 |
| ·副溶血弧菌的三型分泌系统 | 第20-21页 |
| ·三型分泌系统 Needle 的研究进展 | 第21-23页 |
| ·基因工程单链抗体 | 第23-26页 |
| ·单链抗体的研究进展 | 第23页 |
| ·单链抗体的结构及其应用 | 第23-24页 |
| ·单链抗体的噬菌体展示系统 | 第24-25页 |
| ·单链抗体的表达 | 第25-26页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第26-28页 |
| 2 副溶血弧菌 NEEDLE 单聚体的高效表达 | 第28-48页 |
| 引言 | 第28页 |
| ·实验材料 | 第28-30页 |
| ·菌株及载体 | 第28-29页 |
| ·引物序列 | 第29页 |
| ·培养基与抗生素 | 第29页 |
| ·试剂 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-39页 |
| ·Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 基因组的提取 | 第30-31页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第31页 |
| ·PCR 引物的设计 | 第31-32页 |
| ·PCR 扩增 vp1694 基因 | 第32页 |
| ·DNA 的回收纯化 | 第32页 |
| ·vp1694 基因与载体的酶切 | 第32-33页 |
| ·vp1694 基因与载体的连接 | 第33-34页 |
| ·E.coli BL21 感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·连接产物的转化 | 第34-35页 |
| ·重组质粒的筛选与 PCR、酶切验证 | 第35页 |
| ·重组载体的测序验证 | 第35页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 | 第35-36页 |
| ·GST-vp1694 融合蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| ·TRX-vp1694 融合蛋白的纯化 | 第37页 |
| ·融合蛋白浓度的测定 | 第37-39页 |
| ·结果与分析 | 第39-46页 |
| ·Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 基因组的提取 | 第39页 |
| ·PCR 扩增 vp1694 基因 | 第39-40页 |
| ·pET32a(+)-vp1694 重组载体的初步验证 | 第40-41页 |
| ·pET32a(+)-vp1694 重组载体的测序结果分析 | 第41-42页 |
| ·pGEX-6p-1-vp1694 重组载体的初步验证 | 第42页 |
| ·pGEX-6p-1-vp1694 重组载体的测序结果分析 | 第42-43页 |
| ·TRX-vp1694 与 GST-vp1694 融合蛋白的表达及纯化 | 第43-44页 |
| ·融合蛋白浓度的测定 | 第44-46页 |
| ·讨论 | 第46-47页 |
| ·引物设计 | 第46页 |
| ·融合蛋白表达载体的构建 | 第46页 |
| ·融合表达载体的测序验证 | 第46-47页 |
| ·融合蛋白的表达与纯化 | 第47页 |
| ·融合蛋白浓度的测定 | 第47页 |
| ·小结 | 第47-48页 |
| 3 抗 NEEDLE 单链抗体的淘选与验证 | 第48-70页 |
| 引言 | 第48页 |
| ·实验材料 | 第48-50页 |
| ·菌株 | 第48-49页 |
| ·引物序列 | 第49页 |
| ·主要培养基 | 第49-50页 |
| ·主要材料和试剂 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| ·实验方法 | 第50-60页 |
| ·小鼠免疫 | 第50页 |
| ·小鼠血清效价的测定 | 第50-51页 |
| ·小鼠脾脏总 RNA 的提取 | 第51-52页 |
| ·反转录合成 cDNA 第一链 | 第52页 |
| ·VH基因的 PCR 扩增 | 第52-53页 |
| ·VL基因的 PCR 扩增 | 第53页 |
| ·ScFv 的组装扩增 | 第53-54页 |
| ·ScFv 基因与 pCANTAB5E 载体的 Sfi 和 Not 酶切 | 第54页 |
| ·ScFv 基因与 pCANTAB5E 载体的连接 | 第54-55页 |
| ·E.coli TG1 电转感受态的制备 | 第55页 |
| ·电转构建噬菌体单链抗体文库 | 第55-56页 |
| ·重组噬菌体单链抗体初库的制备 | 第56页 |
| ·噬菌体单链抗体文库的淘选 | 第56-57页 |
| ·单链抗体的 ELISA 筛选 | 第57-58页 |
| ·ScFv 的 PCR、酶切及测序验证 | 第58页 |
| ·ScFv 的可溶性表达验证 | 第58-60页 |
| ·结果与分析 | 第60-68页 |
| ·小鼠血清效价的测定 | 第60页 |
| ·小鼠脾脏总 RNA 的提取 | 第60-61页 |
| ·VH基因的扩增 | 第61页 |
| ·VL基因的扩增 | 第61-62页 |
| ·Linker 基因的扩增 | 第62页 |
| ·ScFv 基因的组装、扩增 | 第62-63页 |
| ·噬菌体抗体文库的构建 | 第63-64页 |
| ·噬菌体单链抗体的淘选 | 第64页 |
| ·噬菌体单链抗体的 ELISA 筛选 | 第64-65页 |
| ·ScFv 单克隆的 PCR、酶切验证 | 第65-66页 |
| ·ScFv 单克隆的测序验证 | 第66-67页 |
| ·ScFv 的周质可溶性表达验证 | 第67-68页 |
| ·讨论 | 第68-69页 |
| ·小鼠免疫 | 第68页 |
| ·ELISA 血清效价的测定 | 第68页 |
| ·脾脏总 RNA 的提取 | 第68页 |
| ·噬菌体抗体文库的构建 | 第68页 |
| ·噬菌体抗体文库的淘选 | 第68-69页 |
| ·噬菌体抗体的 ELISA 筛选 | 第69页 |
| ·ScFv 抗体的可溶性表达验证 | 第69页 |
| ·小结 | 第69-70页 |
| 4 单链抗体的胞内可溶性表达与性质鉴定 | 第70-85页 |
| 引言 | 第70页 |
| ·实验材料 | 第70-71页 |
| ·菌株 | 第70-71页 |
| ·引物序列 | 第71页 |
| ·主要培养基 | 第71页 |
| ·主要材料和试剂 | 第71页 |
| ·主要仪器 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-76页 |
| ·pACYC-Duet-1-Skp-vp1694-scFv 共表达载体的构建 | 第71-72页 |
| ·抗 vp1694-scFv 单链抗体的胞内可溶性表达与纯化 | 第72-73页 |
| ·Westernblot 验证抗原抗体反应 | 第73-74页 |
| ·单链抗体的特异性检测 | 第74页 |
| ·单链抗体的亲和力测定 | 第74-75页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的生物信息学分析 | 第75-76页 |
| ·结果与分析 | 第76-83页 |
| ·pACYC-Duet-1-Skp-vp1694-scFv 共表达载体的构建 | 第76-77页 |
| ·pACYC-Duet-1-Skp-vp1694-scFv 重组质粒的测序验证 | 第77页 |
| ·pACYC-Duet-1-Skp-vp1694-scFv 共表达载体的表达与纯化 | 第77-78页 |
| ·Westernblot 验证抗原抗体反应 | 第78-79页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的特异性检测 | 第79页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的亲和力测定 | 第79-80页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的生物信息学分析 | 第80-83页 |
| ·讨论 | 第83-84页 |
| ·pACYC-Duet-1-Skp-vp1694-scFv 共表达载体的构建 | 第83页 |
| ·pACYC-Duet-1-Skp-vp1694-scFv 共表达载体的表达与纯化 | 第83页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的特异性检测 | 第83-84页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的亲和力测定 | 第84页 |
| ·抗 vp1694 单链抗体的生物信息学分析 | 第84页 |
| ·小结 | 第84-85页 |
| 5 结论与展望 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 附录 | 第95-97页 |
