| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-9页 |
| 1 前言 | 第9-21页 |
| ·植物焦磷酸酶(PPASE)的研究进展 | 第9-15页 |
| ·巴西橡胶树中PPASE的研究进展 | 第9-10页 |
| ·巴西橡胶树中PPase的种类及其在橡胶合成中的调控作用 | 第9-10页 |
| ·巴西橡胶树中PPASE的分子生物学研究情况 | 第10页 |
| ·其它植物中PPASE的研究进展 | 第10-13页 |
| ·结构及其生理功能 | 第10-12页 |
| ·PPase的结构 | 第11-12页 |
| ·PPase的生理功能 | 第12页 |
| ·其它植物中PPase的分子生物学研究进展 | 第12-13页 |
| ·PPASE酶蛋白分离及纯化技术 | 第13-15页 |
| ·无机PPASE酶蛋白分离及纯化 | 第13页 |
| ·V-PPASE酶蛋白分离及纯化 | 第13-15页 |
| ·膜制剂的制备 | 第14页 |
| ·从膜制剂中纯化V-PPASE酶蛋白 | 第14-15页 |
| ·巴西橡胶树(HEVEABRASILIENSIS)的分子生物学研究进展 | 第15-18页 |
| ·橡胶延长因子(REF) | 第15-16页 |
| ·3-羟基3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶 | 第16页 |
| ·含锰的超氧化物歧化酶(MNSOD) | 第16-17页 |
| ·法尼磷酸合成酶 | 第17页 |
| ·巴西橡胶树死皮病相关基因 | 第17-18页 |
| ·RACE克隆的原理及其优点 | 第18-21页 |
| ·3′RACE克隆的原理 | 第18-19页 |
| ·5′RACE克隆的原理 | 第19-20页 |
| ·与几种常见克隆技术相比，RACE克隆技术的优势 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-38页 |
| ·试验材料及处理 | 第21页 |
| ·菌种 | 第21页 |
| ·生化试剂 | 第21页 |
| ·实验方法 | 第21-38页 |
| ·橡胶胶乳总RNA的提取 | 第21-23页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)基因部分序列的克隆(EST克隆) | 第23-27页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·反转录扩增(RT-PCR) | 第23-24页 |
| ·PCR产物的凝胶电泳观察 | 第24页 |
| ·PCR产物的回收 | 第24页 |
| ·PCR目的片段的克隆及重组子筛选 | 第24-27页 |
| ·重组子菌种的保存 | 第27页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)基因的5′ RACE克隆 | 第27-28页 |
| ·引物设计 | 第27页 |
| ·5′ RACE-Ready cDNA的合成 | 第27-28页 |
| ·5′ RACE的PCR扩增 | 第28页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)的3′RACE克隆 | 第28-29页 |
| ·引物设计 | 第28页 |
| ·3′ RACE-Ready cDNA的合成 | 第28-29页 |
| ·3′RACE的PCR扩增 | 第29页 |
| ·NORTHERN杂交 | 第29-32页 |
| ·探针的制备 | 第29-30页 |
| ·橡胶胶乳总RNA的提取 | 第30页 |
| ·RNA的印迹转移 | 第30-32页 |
| ·电泳系统等实验用具的预处理 | 第30页 |
| ·RNA的甲醛变性电泳 | 第30页 |
| ·RNA的印迹转移 | 第30-32页 |
| ·甲醛变性胶的处理 | 第30-31页 |
| ·尼龙膜的处理 | 第31-32页 |
| ·杂交 | 第32页 |
| ·预杂交 | 第32页 |
| ·探针杂交 | 第32页 |
| ·洗膜和检测 | 第32页 |
| ·胶乳中焦磷酸酶(PPASE)活性的测定 | 第32-33页 |
| ·样品的采集 | 第32页 |
| ·粗酶液的获得 | 第32页 |
| ·底物的配置 | 第32-33页 |
| ·PPase酶活测定的酶促反应 | 第33页 |
| ·酶促反应后无机磷释(Pi)放量的测定 | 第33页 |
| ·酶活性单位的定义 | 第33页 |
| ·C—乳清蛋白质含量的测定 | 第33页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPASE)基因的原核表达 | 第33-38页 |
| ·表达引物的设计 | 第33-34页 |
| ·表达片段的PCR扩增 | 第34页 |
| ·表达目的片段和载体的制备 | 第34-35页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第35-36页 |
| ·诱导表达 | 第36-37页 |
| ·PET-EP原核表达蛋白的提取和SDS—PAGE电泳鉴定 | 第37-38页 |
| 3 结果和分析 | 第38-52页 |
| ·胶乳总RNA的提取 | 第38页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPASE)基因的EST克隆 | 第38-40页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)EST的PCR扩增及阳性重组子的筛选 | 第38-39页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)基因的EST克隆测序及序列分析 | 第39-40页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)基因的5′ RACE克隆 | 第40-41页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)基因的3′ RACE克隆 | 第41-42页 |
| ·焦磷酸酶(V-PPase)基因全长cDNA克隆的获得 | 第42-45页 |
| ·V-PPASE酶蛋白结构预测分析 | 第45-46页 |
| ·NORTHERN杂交结果与分析 | 第46-47页 |
| ·用于Northern杂交印迹转移的胶乳总RNA的电泳检测 | 第46-47页 |
| ·Northern杂交信号的检测结果 | 第47页 |
| ·JA处理的各样品的Northern杂交结果 | 第47页 |
| ·ET处理的各样品的Northern杂交结果 | 第47页 |
| ·胶乳中焦磷酸酶(PPASE)活性的测定结果与分析 | 第47-49页 |
| ·外源JA和ET处理后，胶乳中V-PPase酶活性的变化 | 第47-48页 |
| ·外源JA和ET处理后，inorganic PPase酶活性的变化 | 第48-49页 |
| ·V-PPASE基因原核表达结果与分析 | 第49-50页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第49-50页 |
| ·原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳 | 第50页 |
| ·本研究中所用到的部分试剂及其配方 | 第50-52页 |
| 4 结论和讨论 | 第52-54页 |
| ·结论 | 第52页 |
| ·讨论 | 第52-54页 |
| 3.结束语： | 第54-56页 |
| 附录一 缩略词表 | 第56-57页 |
| 附录二 DNA测序图谱 | 第57-60页 |
| 附录三 酶活测定数据分析的部分SAS程序 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
