| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 引言 | 第10-24页 |
| ·弹性蛋白酶 | 第10-18页 |
| ·弹性蛋白酶的来源与分布 | 第10-11页 |
| ·人源胰蛋白酶研究进展 | 第11-13页 |
| ·弹性蛋白酶的结构与特点 | 第13-14页 |
| ·弹性蛋白酶降解弹性蛋白的作用机理 | 第14-16页 |
| ·弹性蛋白酶的应用 | 第16-18页 |
| ·大肠杆菌和毕赤酵母表达体系的研究 | 第18-22页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第18-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第20-22页 |
| ·本研究的目的意义 | 第22-24页 |
| 2 人胰弹性蛋白酶28 基因的克隆及测序分析 | 第24-35页 |
| ·材料 | 第24-25页 |
| ·样品 | 第24页 |
| ·菌种及质粒 | 第24页 |
| ·酶及生化试剂 | 第24页 |
| ·试剂与缓冲液 | 第24-25页 |
| ·主要仪器设备 | 第25页 |
| ·方法 | 第25-29页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·RNA 的抽提 | 第25-26页 |
| ·RNA 的检测 | 第26页 |
| ·cDNA 第一链合成 | 第26页 |
| ·弹性蛋白酶28 基因cDNA 片段PCR 扩增程序 | 第26-27页 |
| ·目的片段克隆与测序 | 第27-29页 |
| ·结果与分析 | 第29-33页 |
| ·肾脏组织总RNA 的提取 | 第29-30页 |
| ·弹性蛋白酶基因28 基因片段的克隆 | 第30页 |
| ·载体构建及片段分析 | 第30-32页 |
| ·人源弹性蛋白酶28 结构预测 | 第32-33页 |
| ·讨论 | 第33-35页 |
| 3 弹性蛋白酶28 基因原核载体构建及表达 | 第35-46页 |
| ·实验材料 | 第35-36页 |
| ·试验菌株、质粒 | 第35页 |
| ·酶及生化试剂 | 第35页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第35-36页 |
| ·主要仪器和设备 | 第36页 |
| ·方法 | 第36-42页 |
| ·重组质粒DNA 提取 | 第36-37页 |
| ·引物设计及合成 | 第37页 |
| ·PCR 方法获得不含信号肽的ELA28 基因序列 | 第37-38页 |
| ·重组质粒pGEM-T easy/ELA28 的构建 | 第38页 |
| ·pGEM-T easy/ELA28 阳性质粒的提取及酶切鉴定 | 第38页 |
| ·克隆片段DNA 序列测定 | 第38页 |
| ·pET30a/ELA28 载体的构建 | 第38-40页 |
| ·提取pET30a/ELA28 重组质粒DNA | 第40页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第40页 |
| ·转化表达宿主 | 第40-41页 |
| ·目的基因的原核表达 | 第41页 |
| ·包涵体复性 | 第41页 |
| ·菌体总蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） | 第41-42页 |
| ·结果 | 第42-44页 |
| ·不含信号肽 ELA28 基因片段的扩增 | 第42页 |
| ·重组质粒pGEM-T easy/ELA28 双酶切鉴定 | 第42-43页 |
| ·不含信号肽ELA28 基因测序图 | 第43页 |
| ·重组质粒pET 30a /ELA28 双酶切鉴定 | 第43-44页 |
| ·重组质粒pET30a/ELA28 在大肠杆菌中的表达 | 第44页 |
| ·讨论 | 第44-46页 |
| 4 弹性蛋白酶28 基因真核载体构建及表达 | 第46-63页 |
| ·试验材料 | 第46-49页 |
| ·试验菌株、质粒 | 第46页 |
| ·试剂与缓冲液 | 第46-47页 |
| ·酶及生化试剂 | 第47页 |
| ·培养基 | 第47-48页 |
| ·贮备液 | 第48页 |
| ·主要仪器和设备 | 第48-49页 |
| ·方法 | 第49-56页 |
| ·重组菌株质粒的提取 | 第49页 |
| ·PCR 引物的设计 | 第49页 |
| ·PCR 方法获得不含信号肽ELA28 基因 | 第49-50页 |
| ·重组质粒pGEM-T easy/ELA28 的构建 | 第50页 |
| ·pGEM-T easy/ELA28 质粒的提取及酶切鉴定 | 第50页 |
| ·克隆片段DNA 序列测定 | 第50页 |
| ·ELA28 基因表达载体的构建 | 第50-52页 |
| ·pPIC9K/ELA28 阳性克隆的筛选和鉴定 | 第52页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第52-53页 |
| ·重组子的PCR 鉴定 | 第53页 |
| ·重组转化子甲醇利用型的平板筛选 | 第53页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第53-54页 |
| ·ELA28 基因在毕赤酵母G5115 中的诱导表达 | 第54页 |
| ·发酵上清液中弹性蛋白酶活性检测 | 第54页 |
| ·重组弹性蛋白酶蛋白含量测定 | 第54-55页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶的制备及发酵上清液蛋白质电泳 | 第55-56页 |
| ·结果与分析 | 第56-61页 |
| ·构建重组质粒pGEM-T easy/ ELA28 | 第56页 |
| ·构建重组表达质粒 pPIC9K/ELA2B | 第56-57页 |
| ·重组质粒pPIC9K/ELA28 测序图 | 第57页 |
| ·pPIC9K/ELA28 电击转化毕赤酵母及酵母转化子的筛选 | 第57-58页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型筛选 | 第58页 |
| ·ELA28 基因多拷贝整合子筛选 | 第58-59页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第59-60页 |
| ·酵母转化子诱导表达及弹性蛋白酶活性检测 | 第60页 |
| ·弹性蛋白酶SDS-PAGE 电泳 | 第60-61页 |
| ·讨论 | 第61-63页 |
| 5 结论和展望 | 第63-65页 |
| ·结论 | 第63页 |
| ·展望 | 第63-65页 |
| ·原核表达 | 第63页 |
| ·真核表达 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 在读期间发表的的学术论文 | 第71-72页 |
| 作者简历 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
