| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 1 前言 | 第11-24页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第11页 |
| ·血栓的形成与溶解机制 | 第11-13页 |
| ·溶栓剂的研究进展 | 第13-14页 |
| ·第一代溶栓剂 | 第13页 |
| ·第二代溶栓剂 | 第13-14页 |
| ·第三代溶栓剂 | 第14页 |
| ·纤溶酶的来源及研究现状 | 第14-20页 |
| ·纤溶酶的来源 | 第14-15页 |
| ·纤溶酶的研究进展 | 第15-20页 |
| ·pET28a 简介 | 第20页 |
| ·大肠杆菌表达系统简介 | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究进展 | 第21-22页 |
| ·本研究的主要内容和目标 | 第22-24页 |
| 2 芽孢杆菌ZLW-2 纤溶酶基因的克隆 | 第24-34页 |
| ·材料与方法 | 第24-30页 |
| ·菌株与质粒 | 第24页 |
| ·仪器设备 | 第24页 |
| ·主要培养基及试剂 | 第24-25页 |
| ·引物设计与合成 | 第25-26页 |
| ·芽孢杆菌ZLW-2 全基因组DNA 的提取 | 第26页 |
| ·目的基因的扩增 | 第26-27页 |
| ·扩增产物验证 | 第27页 |
| ·PCR 产物回收 | 第27-28页 |
| ·克隆质粒pMD18-T-FE 的构建 | 第28页 |
| ·大肠杆菌JM109 感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| ·转化大肠杆菌JM109 感受态细胞 | 第29页 |
| ·蓝白斑筛选阳性克隆 | 第29页 |
| ·克隆基因的验证 | 第29-30页 |
| ·结果与分析 | 第30-34页 |
| ·纤溶酶基因的获得 | 第30-31页 |
| ·重组质粒的酶切验证 | 第31页 |
| ·纤溶酶基因的序列分析 | 第31-33页 |
| ·纤溶酶的结构预测 | 第33-34页 |
| 3 前纤溶酶原，纤溶酶原和纤溶酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第34-43页 |
| ·材料与方法 | 第34-37页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·酶及生化试剂 | 第34页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·模板基因的制备 | 第34页 |
| ·重组载体的构建 | 第34-35页 |
| ·重组菌的稳定性检测 | 第35-36页 |
| ·纤溶酶的诱导表达 | 第36页 |
| ·融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定 | 第36页 |
| ·酶活测定方法 | 第36-37页 |
| ·包涵体的变性复性 | 第37页 |
| ·纤溶酶异源表达条件的优化 | 第37页 |
| ·结果与分析 | 第37-41页 |
| ·目的基因的获得 | 第38页 |
| ·表达载体的构建 | 第38页 |
| ·转化子遗传稳定性试验 | 第38-39页 |
| ·纤溶酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第39-40页 |
| ·重组菌发酵条件的优化 | 第40-41页 |
| ·讨论 | 第41-43页 |
| 4 纤溶酶原和纤溶酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第43-64页 |
| ·材料与方法 | 第43-50页 |
| ·菌株与质粒 | 第43页 |
| ·酶及生化试剂 | 第43页 |
| ·培养基及有关的溶液配制 | 第43-44页 |
| ·主要设备 | 第44页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第45-46页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及转化[89] | 第46页 |
| ·甲醇利用表型的确定 | 第46页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第46页 |
| ·酵母基因组DNA 的提取 | 第46-47页 |
| ·重组酵母的PCR 验证 | 第47页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中的表达 | 第47页 |
| ·转化子遗传稳定性实验 | 第47页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶的制备及发酵上清液的蛋白质电泳 | 第47页 |
| ·纤溶酶活性的测定 | 第47-48页 |
| ·可溶性蛋白的测定 | 第48-49页 |
| ·表达产物的分离纯化 | 第49页 |
| ·重组酵母发酵工艺条件的优化 | 第49页 |
| ·粗酶液的酶学性质 | 第49-50页 |
| ·结果与分析 | 第50-62页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·pro-nk 基因在毕赤酵母中的表达及表达产物分析 | 第51-55页 |
| ·SephacrylTM S-200 分子筛层析 | 第55-56页 |
| ·酶的分离纯化结果 | 第56页 |
| ·重组酵母菌发酵条件的优化 | 第56-58页 |
| ·重组酵母的酶学性质 | 第58-62页 |
| ·讨论 | 第62-64页 |
| 5 结论 | 第64-65页 |
| 6 参考文献 | 第65-71页 |
| 在读期间发表论文 | 第71-72页 |
| 作者简介 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
