| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 中文文摘 | 第4-9页 |
| 绪论 | 第9-21页 |
| 1 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 | 第9-15页 |
| 2 BMPs的研究与应用 | 第15-18页 |
| 3 分子伴侣 | 第18-19页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第19-21页 |
| 第一章 实验材料与方法 | 第21-39页 |
| 第一节 实验材料 | 第21-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21-22页 |
| ·主要仪器 | 第22页 |
| ·常用培养基和缓冲液 | 第22-25页 |
| ·寡聚核苷酸引物 | 第25-26页 |
| 第二节 实验方法 | 第26-39页 |
| ·质粒的提取 | 第26页 |
| ·限制性内切酶酶切质粒 | 第26页 |
| ·PCR反应 | 第26-27页 |
| ·连接反应 | 第27页 |
| ·细菌的转化 | 第27-28页 |
| ·细菌转化子的鉴定 | 第28页 |
| ·电转化酵母细胞 | 第28-29页 |
| ·酵母转化子的鉴定 | 第29页 |
| ·酵母转化子的小量摇瓶培养 | 第29页 |
| ·酵母转化子的高密度发酵 | 第29-30页 |
| ·表达产物的DOT-BLOT分析 | 第30-31页 |
| ·表达产物N-糖基化酶(Endo H_f)酶切分析 | 第31页 |
| ·表达产物的WESTERN-BLOT分析 | 第31-32页 |
| ·表达产物的分离纯化 | 第32-33页 |
| ·SDS-PAGE电泳(考马斯亮蓝法) | 第33页 |
| ·ELISA方法定量分析rhBMP-4 | 第33-34页 |
| ·经纯化后的rhBMP-4生物活性测定 | 第34-35页 |
| ·hBMP-4全长序列表达载体的构建 | 第35-39页 |
| 第二章 实验结果 | 第39-55页 |
| 第一节 hBMP-4成熟肽在毕赤酵母中的表达、纯化及其生物活性的测定 | 第39-50页 |
| ·酵母转化子高密度发酵和小量摇瓶培养表达量差异 | 第39-40页 |
| ·G8酵母转化子表达产物的纯化 | 第40-44页 |
| ·G8酵母转化子表达产物N-糖基化分析 | 第44-45页 |
| ·G8酵母转化子表达产物N端加工不完全 | 第45-46页 |
| ·小鼠肌袋包埋法鉴定纯化后的rhBMP-4生物活性 | 第46-47页 |
| ·碱性磷酸酶活性测定法鉴定纯化后的rhBMP-4生物活性 | 第47-50页 |
| 第二节 hBMP-4全长在毕赤酵母(GS115)中的表达 | 第50-55页 |
| ·p-hBMP-4/full表达载体的构建(图2-13) | 第50-52页 |
| ·p-hBMP-4/full酵母转化子的筛选 | 第52-53页 |
| ·P-BMP4/full在毕赤酵母中的表达 | 第53-55页 |
| 第三章 分析与讨论 | 第55-61页 |
| 第一节 hBMP-4成熟肽在毕赤酵母中的表达、纯化及其生物活性的测定 | 第55-58页 |
| ·hBMP-4成熟肽高密度发酵和小量摇瓶培养条件下的表量差异 | 第55页 |
| ·G8酵母转化子表达产物N-糖基化分析 | 第55-57页 |
| ·G8酵母转化子表达产物N端加工不完全 | 第57-58页 |
| ·G8酵母转化子表达产物rhBMP-4生理活性鉴定 | 第58页 |
| 第二节 hBMP-4全长在毕赤酵母(GS115)中的表达 | 第58-61页 |
| 第四章 结论 | 第61-63页 |
| 附录1 | 第63-64页 |
| 附录2 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-75页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77-79页 |
| 个人简历 | 第79-81页 |
