| 中文摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 1 前言 | 第18-39页 |
| ·植物抗病毒基因工程 | 第18-24页 |
| ·利用病毒来源的基因的抗病毒策略 | 第18-22页 |
| ·利用非病毒来源的基因的策略 | 第22-24页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性与PTGS | 第24-26页 |
| ·RNaseIII 超家族与 dsRNA | 第26-33页 |
| ·I 型RNaseIII：细菌的RNaseIII 酶和酿酒酵母的Rnt1 酶 | 第28-30页 |
| ·II 型RNaseIII：Drosha 酶类 | 第30页 |
| ·III 型RNaseIII：Dicer 酶类 | 第30-31页 |
| ·RNaseIII 在生命科学领域内的应用 | 第31-33页 |
| ·基因打靶技术 | 第33-37页 |
| ·基因打靶的原理 | 第33-34页 |
| ·打靶载体的构建 | 第34页 |
| ·外源DNA 导人的方式 | 第34页 |
| ·基因打靶的筛选方法 | 第34-36页 |
| ·基因打靶的策略 | 第36-37页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第37-39页 |
| 2 研究报告 | 第39-101页 |
| 第一章 原核表达 dsRNA 抗烟草花叶病毒体系的构建 | 第39-88页 |
| ·材料 | 第39-43页 |
| ·菌株、质粒、培养基和试剂 | 第39-41页 |
| ·引物 | 第41-43页 |
| ·TMV 毒源 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-70页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| ·质粒pKD46 向大肠杆菌中的转化 | 第44页 |
| ·质粒pKD46 的提取 | 第44-45页 |
| ·质粒pKD46 的酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·线性打靶DNA 片段的制备 | 第46页 |
| ·JM109(DE3)/pKD46 和 HMS174(DE3)PlysS/pKD46 电转化感受态细胞的制备 | 第46-47页 |
| ·M-JM109 和 M-HMS174 突变体的构建 | 第47页 |
| ·M-JM109lacY 突变体的构建 | 第47-48页 |
| ·菌落直接法PCR 初步筛选重组菌株 | 第48-49页 |
| ·点杂交和测序进一步鉴定构建的缺失体 | 第49-52页 |
| ·大肠杆菌基因组DNA 的提取 | 第49-50页 |
| ·DNA 探针的标记 | 第50-51页 |
| ·DNA 的固定 | 第51页 |
| ·预杂交和杂交 | 第51-52页 |
| ·杂交信号的检测 | 第52页 |
| ·dsRNA 原核表达载体的构建 | 第52-58页 |
| ·LCP480 载体的构建 | 第53-54页 |
| ·pET-CP480 载体的构建 | 第54-55页 |
| ·pGEM-CP480 载体的构建 | 第55-58页 |
| ·dsRNA 的诱导表达 | 第58-59页 |
| ·dsRNA 的提取 | 第59-60页 |
| ·小量提取dsRNA的方法（Trizol法） | 第59-60页 |
| ·大量提取dsRNA 的方法 | 第60页 |
| ·荧光定量PCR 方法分析dsRNA 的相对表达量 | 第60-61页 |
| ·dsRNA 介导的病毒抗性鉴定 | 第61页 |
| ·植物总RNA 的提取 | 第61-62页 |
| ·植物总RNA 杂交步骤 | 第62-67页 |
| ·RNA 探针的制备 | 第62-63页 |
| ·DIG 标记有效性检测 | 第63-64页 |
| ·甲醛变性凝胶电泳 | 第64-65页 |
| ·转膜 | 第65-66页 |
| ·杂交 | 第66-67页 |
| ·化学发光法检测 | 第67页 |
| ·siRNA 提取和杂交 | 第67-70页 |
| ·siRNA 提取 | 第67-68页 |
| ·PAGE 电泳 | 第68页 |
| ·转膜 | 第68-69页 |
| ·siRNA 杂交和检测 | 第69-70页 |
| ·间接ELISA 检测 | 第70页 |
| ·结果与分析 | 第70-88页 |
| ·rnc 基因和LacY 基因缺失突变株的制备 | 第70-76页 |
| ·pKD46 质粒导入大肠杆菌菌株 | 第70-71页 |
| ·打靶DNA 片段的扩增 | 第71页 |
| ·JM109 (DE3)菌株rnc 基因的敲除 | 第71-72页 |
| ·HMS174(DE3)PlysS 菌株 rnc 基因的敲除 | 第72页 |
| ·M-JM109 菌株LacY 基因的敲除 | 第72-76页 |
| ·不同原核表达载体的构建 | 第76-82页 |
| ·LCP480 载体的构建 | 第76-77页 |
| ·pET-CP480 载体的构建 | 第77-80页 |
| ·pGEM-CP480 载体的构建 | 第80-82页 |
| ·dsRNA 的诱导表达 | 第82-85页 |
| ·dsRNA 介导的病毒抗性 | 第85-86页 |
| ·Northern blot | 第86-88页 |
| 第二章 原核表达的 TMV 不同功能基因 dsRNA 介导的抗病性比较研究 | 第88-101页 |
| ·材料与方法 | 第88-93页 |
| ·菌株和质粒 | 第88-89页 |
| ·引物 | 第89-91页 |
| ·方法 | 第91-93页 |
| ·TMV 不同功能基因的克隆 | 第91-92页 |
| ·TMV 不同功能基因发夹结构表达载体的构建 | 第92-93页 |
| ·dsRNA 的表达、提取和分析 | 第93页 |
| ·TMV 不同功能基因的dsRNA 介导的病毒抗性鉴定 | 第93页 |
| ·TMV 不同功能基因的探针的制备 | 第93页 |
| ·结果与分析 | 第93-101页 |
| ·TMV 不同功能基因的克隆 | 第93-94页 |
| ·TMV 不同功能基因发夹结构表达载体的构建 | 第94-97页 |
| ·dsRNA 的表达、提取和分析 | 第97-98页 |
| ·TMV 不同功能基因dsRNA 介导的病毒抗性鉴定 | 第98-99页 |
| ·Northern blot | 第99-101页 |
| 3 讨论 | 第101-106页 |
| ·大肠杆菌 rnc 基因缺失体的构建 | 第101页 |
| ·原核表达 dsRNA 的最佳体系的建立 | 第101-102页 |
| ·RNA 干扰和PTGS | 第102-104页 |
| ·TMV 不同功能基因来源的 dsRNA 介导的抗病性比较 | 第104-106页 |
| 4 结论 | 第106-107页 |
| 5 参考文献 | 第107-120页 |
| 6 附录 | 第120-133页 |
| ·质粒图谱 | 第120-121页 |
| ·L4440 载体图和相关序列位点 | 第120-121页 |
| ·pGEM~(?)-T Easy 载体图和相关序列位点 | 第121页 |
| ·pET-22b(+)载体图和相关序列位点 | 第121页 |
| ·常用培养基的配制 | 第121-122页 |
| ·抗生素的配制 | 第122-123页 |
| ·常用缓冲液和试剂的配制 | 第123-126页 |
| ·克隆的基因序列 | 第126-133页 |
| ·TMV 复制酶蛋白基因部分序列 | 第126-128页 |
| ·TMV 运动蛋白基因部分序列 | 第128-131页 |
| ·TMVRNA 聚合酶蛋白基因部分序列 | 第131-133页 |
| 7 致谢 | 第133-134页 |
| 8 攻读学位期间发表论文情况 | 第134页 |
