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海南岛橡胶根际嗜铁细菌B.subtilis CAS15筛选及嗜铁素基因dhbC克隆、表达与功能分析

英文缩略词及中文对照表第1-16页
中文摘要第16-19页
ABSTRACT第19-23页
第一章 文献综述第23-63页
 1 植物根系吸收铁的机制第24-27页
   ·机理Ⅰ第24-26页
   ·机理Ⅱ第26-27页
 2 植物缺铁适应性及其调控第27-30页
   ·植物缺铁适应性第27-28页
   ·植物缺铁适应性的调控第28-30页
     ·调节部位第28-29页
     ·缺铁胁迫信号物质第29-30页
 3 土壤微生物改善植物铁营养第30-39页
   ·根际微生物通过分泌嗜铁素,增加土壤中铁的生物有效性第31-37页
     ·嗜铁素的概念及分类第31-36页
     ·根际微生物分泌嗜铁素,增加土壤中铁的生物有效性第36-37页
   ·土壤微生物与植物的共生作用,改善植物的铁营养状况第37-39页
     ·根瘤菌与植物的共生作用,增强植物缺铁的生理响应第37-38页
     ·菌根真菌与植物的共生作用,改善植物的根系形态和提高铁的生物有效性第38-39页
 4 嗜铁菌的筛选第39-44页
   ·嗜铁素在促进植物生长方面的作用第41-42页
   ·嗜铁素在植物病害防治方面的作用第42-43页
   ·常用的嗜铁素检测方法第43页
   ·嗜铁素拮抗菌的筛选第43-44页
 5 嗜铁素相关基因研究进展第44-53页
   ·生物合成相关基因第45-49页
     ·芽孢杆菌嗜铁素生物合成相关基因第45-46页
     ·其它微生物嗜铁素生物合成相关基因第46-49页
   ·调控基因第49-53页
     ·芽孢杆菌嗜铁素调控相关基因第49-51页
     ·其它微生物嗜铁素调控相关基因第51-53页
 6 基因功能研究进展第53-61页
   ·基因的生物信息学分析第54页
   ·基因的时空表达谱分析第54-55页
     ·mRNA 水平的基因表达谱分析第55页
     ·蛋白质水平的表达谱分析第55页
   ·基因的功能预测第55-56页
     ·利用生物信息学进行功能学上的预测第55-56页
     ·从结构学方面预测基因的功能第56页
   ·基因功能的实验学验证第56-61页
     ·基因敲除和基因敲入第56-59页
       ·基因敲除技术的操作步骤第56-57页
       ·基因敲除技术的应用及前景第57-58页
       ·基因敲除技术的缺陷第58-59页
     ·人工染色体的转导第59页
     ·反义技术第59页
     ·microRNA第59-60页
     ·基因诱捕技术和基因诱捕数据库第60页
     ·微阵列分析第60-61页
 7 本研究的目的意义和研究内容第61-63页
   ·目的意义第61页
   ·研究内容第61-63页
第二章 嗜铁细菌枯草芽孢杆菌CAS15 的分离鉴定第63-81页
 1 材料与方法第63-70页
   ·材料第63-64页
     ·土样采集第63页
     ·试剂第63-64页
     ·培养基第64页
   ·方法第64-70页
     ·产嗜铁素细菌的分离筛选第64-65页
       ·CAS 蓝色检测液的制作第64-65页
       ·通用CAS 检测平板制作第65页
       ·菌株的分离与纯化第65页
     ·CAS15 的种类鉴定第65-68页
       ·形态观察及部分生理生化指标的测定第65页
       ·CAS15 的分子鉴定第65-68页
     ·嗜铁素分析第68-69页
       ·嗜铁素的电喷雾离子化质谱分析(ESI-MS)第68-69页
       ·DHB(G)分析第69页
     ·CAS15 分泌嗜铁素的影响因素第69-70页
       ·不同培养基对CAS15 嗜铁素分泌的影响第69页
       ·pH 值的影响第69页
       ·温度的影响第69-70页
       ·碳源的影响第70页
       ·外源氨基酸的影响第70页
 2 结果与分析第70-79页
   ·产嗜铁素细菌的筛选第70-71页
   ·CAS15 的种类鉴定第71-73页
     ·形态特征与生理生化鉴定第71页
     ·分子鉴定第71-73页
   ·嗜铁素的质谱分析第73页
   ·DHB(G)分析第73-74页
   ·CAS15 嗜铁素分泌影响因素第74-79页
     ·培养基对嗜铁素分泌的影响第74-75页
     ·pH 值对嗜铁素分泌的影响第75-76页
     ·温度对嗜铁素分泌的影响第76页
     ·碳源对嗜铁素分泌的影响第76-77页
     ·外源氨基酸对嗜铁素分泌的影响第77-79页
 3 讨论第79-81页
第三章 CAS15 生防效果初步评价第81-92页
 1 材料与方法第81-84页
   ·材料第81-82页
   ·方法第82-84页
     ·室内拮抗试验第82页
       ·室内平板对峙试验第82页
       ·培养液过滤液的抑制作用第82页
     ·CAS15 对芒果炭疽病菌的抑制作用第82-83页
       ·CAS15 菌悬液的制备第82页
       ·炭疽病病原菌孢子悬浮液的制备第82页
       ·CAS15 对芒果炭疽病的抑制作用第82-83页
     ·CAS15 菌液过滤液对黄瓜种子发芽的影响第83-84页
       ·CAS15 菌液过滤液的配制第83页
       ·黄瓜种子消毒、浸种第83-84页
 2 结果与分析第84-90页
   ·室内平板对峙试验第84-85页
   ·培养液过滤液的抑制作用第85-87页
   ·对芒果炭疽病的抑制作用第87-89页
   ·CAS15 菌液过滤液对黄瓜种子发芽率及芽长的影响第89-90页
 3 讨论第90-92页
第四章 CAS15 dhbC 基因的克隆及序列分析第92-114页
 1 材料与方法第92-95页
   ·材料第92页
     ·菌株第92页
     ·试剂第92页
   ·方法第92-95页
     ·CAS15 dhbC 基因的克隆第92-95页
       ·引物设计与合成第92-93页
       ·dhbC 基因的PCR 扩增第93页
       ·PCR 产物回收第93-94页
       ·pMD 18-T Vector 与PCR 产物的连接第94页
       ·感受态细胞(E.coli DH5α)的制备及转化第94-95页
       ·转化子的PCR 检测及测序第95页
     ·CAS15 dhbC 基因序列的生物信息学分析第95页
 2 结果与分析第95-111页
   ·CAS15 dhbC 基因的克隆与序列分析第95-106页
     ·CAS15 dhbC 基因的克隆第95-97页
     ·CAS15 dhbC 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析第97-101页
     ·CAS15 dhbC 基因酶切位点分析第101-103页
     ·CAS15 dhbC 基因编码产物DhbC 氨基酸组成及原子组成第103页
     ·CAS15 dhbC 基因编码产物DhbC 的活性位点第103-104页
     ·DhbC 蛋白同源性分析第104-106页
   ·DhbC 的结构预测第106-111页
     ·氨基酸标度预测第106页
     ·DhbC 的二级结构预测第106-108页
     ·DhbC 的空间结构预测第108-111页
       ·卷曲螺旋结构域预测第108-109页
       ·DhbC 的α-碳偏差值分析第109页
       ·DhbC 的抑制分配率分析第109页
       ·DhbC 的毒力分配率分析第109-111页
       ·DhbC 的三级结构预测第111页
 3 讨论第111-114页
第五章 CAS15 dhbC 基因的原核表达第114-129页
 1 材料与方法第114-123页
   ·材料第114页
     ·菌株、质粒第114页
     ·试剂第114页
   ·方法第114-123页
     ·表达载体的构建第114-118页
       ·质粒pMD-dhbC 和pET-30a(+)的提取与纯化第114-115页
       ·质粒pMD-dhbC 双酶切及dhbC 基因片段的回收第115-116页
       ·表达载体pET-30a(+)双酶切及大片段的回收第116-117页
       ·dhbC 基因与pET-30a(+)大片段的连接第117页
       ·E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化第117-118页
       ·重组子的菌液PCR 鉴定第118页
       ·重组质粒的提取及双酶切鉴定第118页
     ·dhbC 基因的诱导表达第118-121页
       ·工程菌的诱导第118-119页
       ·SDS-PAGE 分析第119-120页
       ·最佳诱导温度分析第120页
       ·重组蛋白DhbC 可溶性分析第120-121页
     ·表达产物的纯化第121页
     ·重组蛋白DhbC 的Western blotting 分析第121-123页
       ·Western-blotting 所用的试剂和缓冲液第121-122页
       ·Western-blotting 杂交的步骤第122-123页
 2 结果与分析第123-127页
   ·表达载体的构建与工程菌的筛选第123-124页
   ·dhbC 基因在大肠杆菌中的表达第124-125页
   ·最佳诱导温度分析第125页
   ·重组蛋白 DhbC 可溶性分析第125-126页
   ·表达产物的纯化第126页
   ·重组蛋白 DhbC Western blot 分析第126-127页
 3 讨论第127-129页
第六章 B.subtilis CAS15 嗜铁素基因 dhbC 功能验证第129-139页
 1 材料与方法第129-134页
   ·材料第129页
     ·供试菌株第129页
     ·载体和质粒第129页
   ·方法第129-134页
     ·引物设计与合成第129-130页
     ·新霉素抗性基因(neo~r)DNA 片段的获得第130页
     ·枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化第130-131页
       ·枯草芽孢杆菌感受态制备培养基第130页
       ·枯草芽孢杆菌感受态制备第130-131页
       ·转化第131页
     ·同源重组转化子的检测第131页
     ·dhbC 基因的重新导入第131页
     ·回复株斑点杂交验证第131-133页
       ·所需溶液的配制第131-132页
       ·杂交探针的制备第132-133页
       ·DNA 的变性和固定第133页
       ·杂交第133页
       ·洗膜和显色第133页
     ·dhbC 基因的功能验证第133-134页
 2 结果与分析第134-137页
   ·neo~r DNA 片段的获得第134页
   ·dhbC 基因的敲除和缺失突变株的获得第134-135页
   ·dhbC 基因的重新导入和回复株的 PCR 鉴定第135-136页
   ·回复株的斑点杂交检测第136页
   ·dhbC 基因功能验证第136-137页
 3 讨论第137-139页
结论与展望第139-143页
参考文献第143-161页
附录第161-164页
致谢第164-165页
攻读学位期间发表论文情况第165页

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