| 本论文创新性工作 | 第1-5页 |
| 中文摘要 | 第5-8页 |
| 英文摘要 | 第8-12页 |
| 常用英文缩写词汇含义说明 | 第12-21页 |
| 第一部分 文献综述 | 第21-49页 |
| 第一章 疱疹病毒US3基因研究进展 | 第21-49页 |
| 1 疱疹病毒US3基因在基因组中定位 | 第23页 |
| 2 疱疹病毒US3蛋白与病毒成熟、释放 | 第23-30页 |
| 3 疱疹病毒US3蛋白与免疫逃逸、潜伏感染 | 第30-33页 |
| 4 疱疹病毒US3蛋白与病毒的传播、致病性 | 第33-36页 |
| 5 疱疹病毒US3蛋白与细胞凋亡 | 第36-49页 |
| ·细胞凋亡概念和生物学意义 | 第36-37页 |
| ·细胞凋亡的机理 | 第37-45页 |
| ·死亡受体通路 | 第37-39页 |
| ·线粒体通路 | 第39-40页 |
| ·内质网通路 | 第40-42页 |
| ·细胞凋亡相关的部分调控基因及表达产物 | 第42-45页 |
| ·疱疹病毒US3蛋白与细胞凋亡 | 第45-49页 |
| 第二部分 试验研究 | 第49-158页 |
| 第二章 DEV US3基因发现、克隆及分子特性分析 | 第49-76页 |
| 1 材料 | 第49-51页 |
| 2 方法 | 第51-58页 |
| ·DEV US3基因的发现 | 第51页 |
| ·DEV US3基因鉴定 | 第51-56页 |
| ·DEV病毒的增殖 | 第51页 |
| ·DEV DNA的提取 | 第51-52页 |
| ·US3基因的T克隆和鉴定 | 第52-56页 |
| ·DEV US3基因生物信息学分析 | 第56-58页 |
| 3 结果 | 第58-70页 |
| ·DEV US3基因的发现 | 第58-59页 |
| ·DEV US3基因的克隆和鉴定结果 | 第59-61页 |
| ·DEV US3基因的PCR扩增结果 | 第59页 |
| ·DEV US3基因T克隆及鉴定结果 | 第59-61页 |
| ·DEV US3基因生物信息学分析结果 | 第61-70页 |
| ·DEV US3基因系统进化树构建 | 第61-62页 |
| ·DEV US3核酸序列及其推导氨基酸序列一般特性分析 | 第62-63页 |
| ·DEV US3蛋白亚细胞定位分析结果 | 第63-65页 |
| ·DEV US3蛋白翻译后修饰预测 | 第65-67页 |
| ·DEV US3蛋白序列疏水性分析 | 第67-68页 |
| ·DEV US3蛋白抗原性分析 | 第68-69页 |
| ·DEV US3蛋白质高级结构预测结果 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-74页 |
| ·DEV US3基因的发现 | 第70-71页 |
| ·DEV US3蛋白与其它α疱疹病毒US3蛋白的系统进化关系 | 第71页 |
| ·DEV US3蛋白一般理化特征 | 第71-72页 |
| ·DEV US3蛋白亚细胞定位预测 | 第72页 |
| ·DEV US3蛋白翻译后修饰 | 第72页 |
| ·DEV US3蛋白高级结构特点 | 第72-74页 |
| 5 小结 | 第74-76页 |
| 第三章 DEV US3基因原核载体构建、表达、产物纯化及其抗体制备 | 第76-97页 |
| 1 试验材料 | 第76-77页 |
| 2 试验方法 | 第77-85页 |
| ·pET32-US3重组原核表达质粒的构建和鉴定 | 第77-79页 |
| ·重组载体pMD18T-US3的酶切和US3基因片段的纯化回收 | 第77-78页 |
| ·原核表达载体pET32a(+)双酶切线性化及纯化回收 | 第78页 |
| ·线性pET32a(+)质粒与酶切回收US3序列的连接 | 第78-79页 |
| ·DH5a感受态细胞的制备 | 第79页 |
| ·重组pET32a-US3质粒的转化与DH5 | 第79页 |
| ·重组pET32a-US3质粒的提取 | 第79页 |
| ·重组pET32a-US3质粒的酶切鉴定 | 第79页 |
| ·重组质粒pET32a-US3的诱导表达 | 第79-82页 |
| ·感受态表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的制备 | 第79-80页 |
| ·重组质粒pET32a-US3转化表达宿主菌Ecoli BL21(DE3) | 第80页 |
| ·重组质粒pET32-US3阳性E.coli BL21(DE3)菌株的表达鉴定 | 第80页 |
| ·重组质粒pET32a-US3诱导原核表达条件优化 | 第80-81页 |
| ·重组质粒pET32a-US3原核表达产物的可溶性分析 | 第81-82页 |
| ·重组质粒pET32a-US3原核表达蛋白的纯化 | 第82-83页 |
| ·重组质粒pET32a-US3大量诱导表达 | 第82页 |
| ·重组质粒pET32a-US3原核表达蛋白的镍离子亲和层析纯化 | 第82-83页 |
| ·纯化蛋白的复性 | 第83页 |
| ·兔抗DEV-US3融合表达蛋白多克隆抗体IgG的制备 | 第83-84页 |
| ·兔抗DEV-US3血清的制备 | 第83页 |
| ·兔抗DEV-US3血清效价测定 | 第83-84页 |
| ·兔抗DEV-US3融合表达蛋白多克隆抗体IgG的纯化 | 第84-85页 |
| ·IgG的辛酸-硫酸铵(CA-AS)粗提 | 第84页 |
| ·阴离子交换层析纯化IgG | 第84-85页 |
| ·纯化抗体IgG特异性检测 | 第85页 |
| 3 试验结果 | 第85-92页 |
| ·原核重组表达载体pET32a-US3的构建 | 第85-86页 |
| ·重组载体pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌的诱导表达 | 第86-89页 |
| ·重组质粒pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌的表达鉴定 | 第86页 |
| ·重组质粒pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌诱导表达条件的优化 | 第86-89页 |
| ·重组质粒pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌诱导表达产物可溶性分析 | 第89页 |
| ·融合表达蛋白pET32a-US3的纯化 | 第89-90页 |
| ·兔抗DEV-US3血清制备 | 第90-92页 |
| ·抗体效价的ELISA检测 | 第90页 |
| ·抗DEV-US3血清的IgG的纯化 | 第90-91页 |
| ·蛋白免疫印迹性检验纯化IgG的特异性 | 第91-92页 |
| 4 讨论与分析 | 第92-95页 |
| ·DEV-US3基因表达体系的选择 | 第92-93页 |
| ·DEV-US3在原核表达系统中的表达 | 第93-94页 |
| ·融合表达蛋白的纯化 | 第94页 |
| ·抗DEV-US3血清IgG的制备 | 第94-95页 |
| 5 小结 | 第95-97页 |
| 第四章 鸭病毒性肠炎病毒US3基因在宿主细胞内的转录时相、表达时相和US3蛋白亚细胞定位 | 第97-114页 |
| 1 试验材料 | 第97-98页 |
| 2 试验方法 | 第98-103页 |
| ·引物设计 | 第98页 |
| ·鸭成纤维细胞的培养 | 第98-99页 |
| ·DEV US3基因转录时相 | 第99-102页 |
| ·DEV病毒的增殖 | 第99页 |
| ·细胞总RNA提取 | 第99页 |
| ·基因组DNA的去除 | 第99-100页 |
| ·反转录 | 第100-101页 |
| ·普通聚合酶链式反应 | 第101页 |
| ·PCR产物回收 | 第101页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第101-102页 |
| ·Real-time PCR扩增标准曲线的建立 | 第102页 |
| ·DEV US3转录时相结果和数据处理 | 第102页 |
| ·DEV US3基因表达时相和亚细胞定位 | 第102-103页 |
| ·DEV病毒的增殖 | 第102页 |
| ·间接免疫荧光检测条件优化 | 第102-103页 |
| ·间接免疫荧光检测的特异性 | 第103页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV US3蛋白的表达和定位 | 第103页 |
| 3 结果 | 第103-109页 |
| ·DEV US3基因转录时相 | 第103-107页 |
| ·细胞总RNA提取 | 第103页 |
| ·RT-PCR检测 | 第103页 |
| ·实时荧光定量检测标准曲线的建立 | 第103-104页 |
| ·DEV US3基因的转录量分析 | 第104-107页 |
| ·DEV US3基因表达时相和亚细胞定位 | 第107-109页 |
| ·间接免疫荧光检测条件优化 | 第107-108页 |
| ·间接免疫荧光检测的特异性 | 第108页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV US3蛋白的表达和定位 | 第108-109页 |
| 4 讨论 | 第109-112页 |
| ·DEV US3基因转录时相和表达时相 | 第109-110页 |
| ·DEV US3蛋白亚细胞定位 | 第110-112页 |
| 5 小结 | 第112-114页 |
| 第五章 抗鸭病毒性肠炎病毒US3基因原核表达蛋白抗体介导的酶免疫组化检测DEV的研究和应用 | 第114-126页 |
| 1 试验材料 | 第114-115页 |
| 2 试验方法 | 第115-117页 |
| ·鸭人工感染DEV试验 | 第115页 |
| ·组织包埋及切片 | 第115-116页 |
| ·载(盖)玻片准备 | 第115-116页 |
| ·组织包埋及切片 | 第116页 |
| ·间接免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的建立 | 第116-117页 |
| ·兔抗DEV-US3蛋白IgG制备 | 第116页 |
| ·免疫组化反应条件的优化 | 第116页 |
| ·间接免疫组化检测DEV-US3蛋白特异性 | 第116-117页 |
| ·结果判定 | 第117页 |
| ·间接免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的应用 | 第117页 |
| ·鸭病毒性肠炎临床样本进行检验 | 第117页 |
| ·人工感染DEV鸭组织中DEV-US3基因的表达时相及其蛋白分布 | 第117页 |
| 3 试验结果 | 第117-122页 |
| ·间接酶免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的建立 | 第117-119页 |
| ·酶免疫组化方法检测DEV-US3蛋白条件优化 | 第117页 |
| ·间接免疫组化检测DEV-US3蛋白特异性 | 第117-119页 |
| ·间接酶免疫组化检测DEV US3蛋白方法的应用 | 第119-122页 |
| ·鸭病毒性肠炎临床样本的检验 | 第119页 |
| ·人工感染DEV鸭组织中DEV US3基因的表达时相及其蛋白分布 | 第119-122页 |
| 4 讨论与分析 | 第122-124页 |
| ·间接免疫组化检测DEV US3蛋白方法的建立 | 第122-123页 |
| ·间接免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的应用 | 第123-124页 |
| 5 小结 | 第124-126页 |
| 第六章 抗鸭病毒性肠炎病毒US3基因原核表达蛋白抗体介导的免疫荧光检测DEV的研究和应用 | 第126-138页 |
| 1 试验材料 | 第127页 |
| 2 试验方法 | 第127-128页 |
| ·人工感染DEV雏鸭组织样品采集、包埋及切片 | 第127页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV-US3蛋白方法的建立 | 第127-128页 |
| ·兔抗DEV-US3蛋白IgG制备 | 第127页 |
| ·免疫荧光检测方法的条件优化 | 第127页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV-US3蛋白特异性 | 第127-128页 |
| ·结果判定 | 第128页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV-US3蛋白方法的应用 | 第128页 |
| ·鸭病毒性肠炎临床样本进行检验 | 第128页 |
| ·人工感染DEV鸭组织中DEV-US3基因的表达时相及其蛋白分布 | 第128页 |
| 3 试验结果 | 第128-133页 |
| ·免疫荧光检测人工感染鸭病毒性肠炎病毒后鸭组织DEV-US3基因编码蛋白方法的建立与优化 | 第128-130页 |
| ·免疫荧光方法检测DEV US3蛋白的建立 | 第128-129页 |
| ·免疫荧光方法检测DEV US3蛋白特异性 | 第129-130页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV US3蛋白方法的应用 | 第130-133页 |
| ·鸭病毒性肠炎临床样本的检验 | 第130页 |
| ·人工感染DEV鸭组织中DEV-US3基因的表达时相及其蛋白分布 | 第130-133页 |
| 4 讨论 | 第133-136页 |
| ·间接免疫荧光检测DEV US3蛋白方法的建立 | 第133-134页 |
| ·间接免疫荧光检测人工感染DEV鸭组织中DEV US3基因的表达时相及其蛋白分布 | 第134-136页 |
| 5 小结 | 第136-138页 |
| 第七章 鸭病毒性肠炎病毒US3基因原核表达蛋白作为包备抗原ELISA检测DEV抗体的研究和应用 | 第138-150页 |
| 1 试验材料 | 第139页 |
| 2 试验方法 | 第139-142页 |
| ·DEV US3基因原核表达蛋白表达与纯化 | 第139-140页 |
| ·DEV-US3蛋白作为包被抗原间接ELISA方法的建立 | 第140-141页 |
| ·最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定 | 第140页 |
| ·酶标二抗最佳工作浓度的确定 | 第140页 |
| ·间接ELISA方法的建立 | 第140-141页 |
| ·ELISA检测临界值的确定 | 第141页 |
| ·ELISA检测特异性检验 | 第141页 |
| ·ELISA检测敏感性 | 第141页 |
| ·ELISA检测重复性 | 第141页 |
| ·间接ELISA方法检测DEV抗体的应用 | 第141-142页 |
| 3 试验结果 | 第142-146页 |
| ·DEV-US3表达蛋白间接ELISA方法的建立 | 第142-146页 |
| ·最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度的确定 | 第142-143页 |
| ·酶标二抗最适工作浓度的确定 | 第143页 |
| ·ELISA阴阳性临界值的确定 | 第143-144页 |
| ·间接ELISA检测的特异性 | 第144-145页 |
| ·间接ELISA检测的敏感性 | 第145-146页 |
| ·间接ELISA检测的重复性 | 第146页 |
| ·间接ELISA对临床血清样品的检测 | 第146页 |
| 4 讨论 | 第146-148页 |
| 5 小结 | 第148-150页 |
| 第八章 基于鸭病毒性肠炎病毒US3基因PCR方法的建立和应用 | 第150-158页 |
| 1 试验材料 | 第150-151页 |
| 2 试验方法 | 第151-153页 |
| ·核酸DNA的提取 | 第151页 |
| ·细胞病毒的DNA提取 | 第151页 |
| ·细菌菌株DNA的提取 | 第151页 |
| ·组织中DNA的提取 | 第151页 |
| ·DEV-US3基因PCR检测DEV方法的建立 | 第151-153页 |
| ·引物的设计 | 第151-152页 |
| ·DEV-US3基因PCR反应体系的建立 | 第152页 |
| ·PCR检测灵敏性 | 第152页 |
| ·PCR检测特异性 | 第152-153页 |
| ·PCR方法对病料组织的检测 | 第153页 |
| 3 试验结果 | 第153-155页 |
| ·PCR扩增DEV强毒株DNA结果 | 第153页 |
| ·PCR检测DEV方法的灵敏性 | 第153-154页 |
| ·PCR检测DEV方法的特异性 | 第154页 |
| ·PCR检测DEV方法的临床应用 | 第154-155页 |
| 4 讨论 | 第155-156页 |
| 5 小结 | 第156-158页 |
| 第三部分 结论 | 第158-160页 |
| 第四部分 参考文献 | 第160-176页 |
| 第五部分 致谢 | 第176-177页 |
| 作者简介 | 第177-178页 |
| 附表:常见试剂的配制 | 第178-185页 |
| 附图1——免疫组化染色 | 第185-192页 |
| 附图2——免疫荧光染色 | 第192-197页 |
