| 摘要 | 第1-6页 |
| SUMMARY | 第6-16页 |
| Ⅰ 文献综述 | 第16-34页 |
| 1 臌胀病发生机理及影响因子 | 第16-23页 |
| ·臌胀病发生机制 | 第16-17页 |
| ·臌胀因子 | 第17-23页 |
| ·可溶性蛋白 | 第17页 |
| ·类脂物 | 第17页 |
| ·皂素 | 第17-18页 |
| ·果胶物质 | 第18页 |
| ·初始消化速率 | 第18-19页 |
| ·浓缩单宁 | 第19-23页 |
| 2 苜蓿抗臌胀病育种进展 | 第23-25页 |
| ·低初始消化速率选择的苜蓿选择育种 | 第23-24页 |
| ·生物技术在苜蓿抗臌胀病育种中的应用 | 第24页 |
| ·基因工程在苜蓿抗臌胀病育种中的应用 | 第24-25页 |
| 3 苜蓿的遗传转化研究 | 第25-28页 |
| ·苜蓿再生体系的研究 | 第25-27页 |
| ·苜蓿遗传转化的研究 | 第27-28页 |
| 4 植物启动子研究进展 | 第28-34页 |
| ·组成型启动子 | 第28页 |
| ·诱导型启动子 | 第28-29页 |
| ·组织特异型启动子 | 第29-34页 |
| Ⅱ 研究内容及意义 | 第34-35页 |
| Ⅲ 技术路线 | 第35-36页 |
| Ⅳ 实验部分 | 第36-103页 |
| 第一章 PNZIP启动子的克隆及鉴定 | 第36-57页 |
| 1 实验材料 | 第36-38页 |
| ·植物材料 | 第36-37页 |
| ·菌株及质粒 | 第37页 |
| ·酶与试剂 | 第37页 |
| ·引物设计 | 第37页 |
| ·培养基 | 第37页 |
| ·缓冲液 | 第37-38页 |
| 2实验方法 | 第38-46页 |
| ·裂叶牵牛总基因组DNA的提取 | 第38页 |
| ·PNZIP基因启动子的扩增 | 第38-39页 |
| ·目的片段的回收 | 第39页 |
| ·目的片段与pGEM-T easy Vector载体的连接 | 第39页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第39-40页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第40页 |
| ·小量碱法提取质粒 | 第40-41页 |
| ·重组质粒的滞后鉴定 | 第41页 |
| ·重组质粒的PCR鉴定 | 第41页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定体系 | 第41页 |
| ·重组质粒的测序 | 第41页 |
| ·PNZIP基因序列的生物信息学分析 | 第41页 |
| ·PNZIP启动子驱动的GFP基因植物表达载体构建 | 第41-44页 |
| ·植物表达载体pPNGFP转化根癌农杆菌EHA105 | 第44-45页 |
| ·农杆菌感受态的制备 | 第44-45页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的转化 | 第45页 |
| ·农杆菌工程菌的鉴定 | 第45页 |
| ·根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法 | 第45-46页 |
| ·工程菌准备 | 第45页 |
| ·受体材料准备 | 第45-46页 |
| ·转化 | 第46页 |
| ·转基因植株的PCR鉴定 | 第46页 |
| ·转基因烟草绿色荧光蛋白表达活性的检测 | 第46页 |
| 3 结果分析 | 第46-56页 |
| ·裂叶牵牛基因组总DNA纯度及完整性 | 第46-47页 |
| ·PNZIP启动子的克隆 | 第47页 |
| ·PNZIP启动子的序列分析 | 第47-50页 |
| ·PNZIP序列生物信息学分析 | 第50-51页 |
| ·转录起始位点分析 | 第51-52页 |
| ·PNZIP启动子驱动的绿色荧光蛋白植物表达载体构建 | 第52-53页 |
| ·pPNGFP转化农杆菌EHA105 | 第53页 |
| ·转化烟草植株的获得 | 第53-54页 |
| ·烟草器官组织中的荧光分析 | 第54-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| 第二章 二氢黄酮还原酶基因的克隆 | 第57-72页 |
| 1 实验材料 | 第57-58页 |
| ·植物材料 | 第57页 |
| ·载体与菌株 | 第57页 |
| ·酶与试剂 | 第57页 |
| ·引物设计 | 第57-58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·缓冲液 | 第58页 |
| 2 实验方法 | 第58-65页 |
| ·蒺藜苜蓿RNA的提取和检测 | 第58页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第58-59页 |
| ·PCR反应体系 | 第59页 |
| ·PCR产物的与pGEM-T easy Vector的连接、转化 | 第59-60页 |
| ·转化重组质粒的筛选鉴定 | 第60页 |
| ·重组质粒PCR鉴定 | 第60页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第60页 |
| ·DFR基因原核表达载体的构建 | 第60-63页 |
| ·DFR基因和pET-28a(+)线性片段的制备 | 第60-62页 |
| ·DFR基因和pET-28a(+)线性片段的连接反应体系 | 第62-63页 |
| ·重组子的转化与筛选 | 第63页 |
| ·重组子的鉴定 | 第63页 |
| ·DFR基因的原核表达 | 第63页 |
| ·原核表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第63-65页 |
| 3 结果与分析 | 第65-71页 |
| ·蒺藜苜蓿总RNA提取及完整性 | 第65-66页 |
| ·DFR基因的克隆和测序 | 第66-68页 |
| ·DFR基因的聚类分析 | 第68-69页 |
| ·DFR基因原核表达载体构建 | 第69-70页 |
| ·DFR基因原核表达 | 第70-71页 |
| 4 讨论 | 第71-72页 |
| 第三章 二氢黄酮还原酶基因植物表达载体的构建 | 第72-81页 |
| 1 方法 | 第72-77页 |
| ·植物表达载体pBIDFR、pPNDFR构建流程 | 第72页 |
| ·植物表达载体pBIDFR的构建 | 第72-75页 |
| ·DFR基因片段与线性pBI121的制备 | 第72-74页 |
| ·DFR基因片段与线性pBI121的连接 | 第74-75页 |
| ·重组质粒pBIDFR的鉴定 | 第75页 |
| ·植物表达载体pPNDFR的构建 | 第75-76页 |
| ·PNZIP启动子基因片段与线性pBIDFR的制备 | 第75-76页 |
| ·PNZIP启动子片段与线性pBIDFR的连接 | 第76页 |
| ·重组质粒pPNDFR的鉴定 | 第76页 |
| ·植物表达载体pBIDFR、pPNDFR转化农杆菌EHA105 | 第76页 |
| ·重组子pPNDFR/EHA105、pPNDFR/EHA105的鉴定 | 第76-77页 |
| 2 结果分析 | 第77-79页 |
| ·植物表达载体pBIDFR的构建及检测 | 第77页 |
| ·植物表达载体pPNDFR的构建及检测 | 第77-78页 |
| ·植物表达载体pBIDFR、pPNDFR转化农杆菌 | 第78-79页 |
| 3 讨论 | 第79-81页 |
| ·载体构建 | 第79页 |
| ·农杆菌工程菌的鉴定 | 第79-81页 |
| 第四章 DFR在模式植物中的表达及功能鉴定 | 第81-88页 |
| 1 材料与方法 | 第81-83页 |
| ·材料 | 第81页 |
| ·试验材料 | 第81页 |
| ·载体菌株 | 第81页 |
| ·方法 | 第81-83页 |
| ·培养基的准备 | 第82页 |
| ·农杆菌介导的烟草遗传转化 | 第82页 |
| ·转基因植株的PCR鉴定 | 第82页 |
| ·转基因烟草CT含量测定 | 第82-83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-86页 |
| ·工程菌对烟草的遗传转化 | 第83-84页 |
| ·PCR扩增检测结果 | 第84-85页 |
| ·转基因烟草浓缩单宁含量测定 | 第85-86页 |
| 3 讨论 | 第86-88页 |
| 第五章 根癌农杆菌介导的PPNDFR转化紫花苜蓿的研究 | 第88-101页 |
| 1 实验材料 | 第88-89页 |
| ·植物材料 | 第88页 |
| ·载体菌株 | 第88页 |
| ·酶与试剂 | 第88-89页 |
| ·基本培养基的准备 | 第89页 |
| 2 方法 | 第89-92页 |
| ·农杆菌工程菌液的准备 | 第89页 |
| ·抗生素(Kan)有效工作浓度的筛选确定 | 第89页 |
| ·遗传转化体系的优化 | 第89-90页 |
| ·外植体预培养对外植体转化出愈率的影响 | 第89页 |
| ·菌液浓度、侵染时间对外植体转化出愈率的影响 | 第89-90页 |
| ·共培养时间对外植体转化出愈率的影响 | 第90页 |
| ·不定芽的选择分化 | 第90页 |
| ·不定芽的伸长、生根 | 第90页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第90页 |
| ·转基因植株的Southern检测 | 第90-92页 |
| 3 结果与分析 | 第92-97页 |
| ·抗生素(Kan)有效工作浓度的筛选确定 | 第92-93页 |
| ·遗传转化体系优化试验 | 第93-95页 |
| ·外植体预培养对外植体转化出愈率的影响 | 第93页 |
| ·菌液浓度对外植体转化出愈率的影响 | 第93-94页 |
| ·共培养时间对外植体转化出愈率的影响 | 第94-95页 |
| ·抗性愈伤组织选择分化培养 | 第95-96页 |
| ·苜蓿抗性植株的获得 | 第96-97页 |
| ·苜蓿抗性植株的Southern杂交鉴定 | 第97页 |
| 4 讨论 | 第97-101页 |
| ·卡那霉素选择压的确定 | 第97-98页 |
| ·遗传转化中预培养时间的确定 | 第98页 |
| ·遗传转化中农杆菌菌液浓度与侵染时间的确定 | 第98-99页 |
| ·共培养时间对转化效率的影响 | 第99页 |
| ·选择分化不定芽诱导的影响因素和选择压的确定 | 第99-101页 |
| 结论 | 第101-103页 |
| Ⅴ 图版说明 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 导师简介 | 第113-114页 |
| 作者简介 | 第114-116页 |
