拟南芥芥子酶基因TGG5的克隆、表达及酶活特性研究
| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 1 前言 | 第10-31页 |
| ·拟南芥概述 | 第10-11页 |
| ·芥子酶研究进展 | 第11-19页 |
| ·芥子酶概述 | 第11-15页 |
| ·芥子酶的分布与细胞定位 | 第12页 |
| ·芥子酶基因及其表达调控 | 第12-14页 |
| ·芥子酶的活性测定 | 第14-15页 |
| ·芥子酶在植物以外生物领域的分布 | 第15页 |
| ·硫代葡萄糖苷-芥子酶系统概述 | 第15-19页 |
| ·硫代葡萄糖苷 | 第15-17页 |
| ·硫代葡萄苷的化学结构及分类 | 第15-16页 |
| ·硫代葡萄糖苷的生物合成及其降解 | 第16-17页 |
| ·硫代葡萄糖苷-芥子酶系统 | 第17-19页 |
| ·基因克隆技术研究进展 | 第19-23页 |
| ·图位克隆技术 | 第20-21页 |
| ·转座子或T-DNA标签 | 第21页 |
| ·同源序列候选基因法 | 第21-22页 |
| ·表达序列标签法(EST) | 第22-23页 |
| ·差异表达基因的分离方法 | 第23页 |
| ·毕赤酵母外源基因表达系统研究进展 | 第23-29页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优缺点 | 第24-25页 |
| ·常用表达菌株 | 第25页 |
| ·常见的表达载体 | 第25-26页 |
| ·转化方法 | 第26页 |
| ·毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略 | 第26-29页 |
| ·外源基因自身的特性 | 第26页 |
| ·选择强启动子 | 第26-27页 |
| ·增加外源基因整合拷贝数 | 第27页 |
| ·载体和宿主的选择 | 第27-28页 |
| ·优化发酵条件 | 第28页 |
| ·防止目的蛋白降解 | 第28-29页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| ·技术路线 | 第30-31页 |
| 2 实验材料、试剂及仪器 | 第31-33页 |
| ·植物材料 | 第31页 |
| ·菌株与质粒 | 第31页 |
| ·酶与生化试剂 | 第31页 |
| ·常用培养基 | 第31-32页 |
| ·主要仪器设备 | 第32-33页 |
| 3 实验方法 | 第33-44页 |
| ·拟南芥芥子酶基因ATTGG5的克隆 | 第33-38页 |
| ·拟南芥总RNA的提取 | 第33页 |
| ·cDNA的合成 | 第33-34页 |
| ·芥子酶基因AtTGG5编码区全长序列的克隆 | 第34-37页 |
| ·引物的设计 | 第34页 |
| ·PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·目的片段的克隆及重组子的筛选与鉴定 | 第35-37页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第35页 |
| ·PCR纯化产物与T载体的连接 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第36页 |
| ·转化大肠杆菌 | 第36页 |
| ·质粒的提取 | 第36-37页 |
| ·酶切鉴定和测序 | 第37页 |
| ·拟南芥TGG5基因的RT-PCR分析 | 第37-38页 |
| ·拟南芥各器官总RNA的提取 | 第37-38页 |
| ·cDNA的合成及TGG5的RT-PCR分析 | 第38页 |
| ·ATTGG5基因酵母表达载体构建及转化 | 第38-41页 |
| ·表达载体的构建 | 第38-40页 |
| ·芥子酶基因ATTGG5编码区的克隆 | 第38-39页 |
| ·ATTGG5基因的酶切 | 第39页 |
| ·AtTGG5基因与载体pPIC3.5K的连接 | 第39-40页 |
| ·克隆和测序 | 第40页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第40-41页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备 | 第40页 |
| ·表达载体的线性化 | 第40页 |
| ·转化 | 第40-41页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第41页 |
| ·TGG5重组蛋白的大量表达及纯化 | 第41-43页 |
| ·重组蛋白的大量表达 | 第41页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第42页 |
| ·酶活性分析 | 第42-43页 |
| ·TGG5重组蛋白的酶学特性研究 | 第43-44页 |
| 4 结果与分析 | 第44-57页 |
| ·拟南芥芥子酶基因ATTGG5的克隆 | 第44-46页 |
| ·拟南芥总RNA的提取 | 第44页 |
| ·AtTGG5全长编码区域的克隆 | 第44-45页 |
| ·拟南芥AtTGG5基因的RT-PCR表达分析 | 第45-46页 |
| ·AtTGG5的生物信息学分析 | 第46-50页 |
| ·AtTGG5基因序列和氨基酸序列 | 第46-47页 |
| ·AtTGG5的蛋白特性分析 | 第47-48页 |
| ·AtTGG5的亚细胞定位 | 第48页 |
| ·AtTGG5的信号肽预测分析 | 第48-49页 |
| ·AtTGG5的疏水性和亲水性分析 | 第49页 |
| ·AtTGG5的跨膜区预测分析 | 第49-50页 |
| ·ATTGG5基因酵母表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·ATTGG5重组蛋白的表达和纯化 | 第51-52页 |
| ·ATTGG5重组蛋白的酶学特性分析 | 第52-57页 |
| ·酶的动力学常数 | 第52-53页 |
| ·pH对酶活力的影响 | 第53-54页 |
| ·抗坏血酸(Vc)对酶活力的影响 | 第54页 |
| ·NaCl浓度对酶活力的影响 | 第54-55页 |
| ·温度对酶活力的影响 | 第55-56页 |
| ·80℃高温条件下酶的稳定性 | 第56-57页 |
| 5 讨论 | 第57-61页 |
| ·关于芥子酶的起源与进化 | 第57-58页 |
| ·关于酵母的转化 | 第58-59页 |
| ·关于芥子酶基因在酵母中的表达与纯化 | 第59页 |
| ·关于酶学活性的分析 | 第59-60页 |
| ·后续问题 | 第60-61页 |
| 6 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 缩略词 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
