| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-34页 |
| 1 课题的提出 | 第14-16页 |
| 2 植物抗寒研究进展 | 第16-32页 |
| ·植物受低温胁迫时的生理反应 | 第16-20页 |
| ·植物形态和解剖结构与抗寒性的关系 | 第16页 |
| ·植物细胞膜结构与抗寒性的关系 | 第16-18页 |
| ·植物保护酶系统与抗寒性的关系 | 第18页 |
| ·渗透调节物质与植物抗寒性的关系 | 第18-20页 |
| ·植物响应低温胁迫的分子机理 | 第20-30页 |
| ·不依赖ABA的低温响应基因表达调控途径 | 第20-28页 |
| ·ICE1-CBF/DREB1调节单元 | 第21-27页 |
| ·CBF/DREB1转录因子 | 第21-23页 |
| ·ICE1转录因子 | 第23-25页 |
| ·ICE1蛋白的修饰和调控 | 第25-27页 |
| ·ICE1-CBF/DREB1调节元的抑制因子 | 第27页 |
| ·非ICE1-CBF/DREB1调节元的低温响应基因 | 第27-28页 |
| ·依赖ABA的低温响应基因表达调控途径 | 第28-30页 |
| ·植物的抗寒基因工程研究进展 | 第30-32页 |
| ·低温响应基因的遗传转化 | 第30-31页 |
| ·植物抗冻蛋白的遗传转化 | 第31页 |
| ·氧化胁迫相关基因的遗传转化 | 第31-32页 |
| ·脂肪酸去饱和酶基因的遗传转化 | 第32页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第32-34页 |
| 第二章 枳PtrICE1基因的克隆、表达及功能分析 | 第34-70页 |
| 1 材料与方法 | 第34-36页 |
| ·试验材料 | 第34-35页 |
| ·菌株与质粒载体 | 第35页 |
| ·酶与试剂盒 | 第35页 |
| ·引物合成 | 第35-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-49页 |
| ·试验材料的准备 | 第36页 |
| ·枳PtrICE1基因克隆 | 第36-42页 |
| ·植物总RNA的抽提 | 第36-37页 |
| ·RNA质量检测与浓度测定 | 第37页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第37页 |
| ·PCR扩增获得PtrICE1基因片段 | 第37-38页 |
| ·PCR产物的回收、纯化 | 第38-39页 |
| ·回收纯化的目的片段与克隆载体的连接 | 第39页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第39页 |
| ·连接产物的转化及重组质粒的蓝白斑筛选 | 第39-40页 |
| ·PtrICE1基因片段测序 | 第40页 |
| ·3' RACE | 第40-41页 |
| ·序列拼接 | 第41页 |
| ·完整的ORF克隆 | 第41-42页 |
| ·生物信息学分析 | 第42页 |
| ·PtrICE1基因在不同的逆境下的表达模式分析 | 第42-43页 |
| ·枳PtrICE1基因超表达载体构建 | 第43-45页 |
| ·小量法提取质粒DNA | 第43页 |
| ·超量表达载体的构建 | 第43-45页 |
| ·根癌农杆菌介导的烟草遗传转化 | 第45-47页 |
| ·根癌农杆菌感受态的制备(CaCl_2法) | 第45-46页 |
| ·工程菌的制备 | 第46页 |
| ·试剂和培养基配制 | 第46页 |
| ·根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草 | 第46-47页 |
| ·转基因烟草Km抗性植株PCR检测 | 第47-48页 |
| ·转基因烟草基因组DNA提取 | 第47-48页 |
| ·转基因烟草PCR检测 | 第48页 |
| ·转基因烟草半定量PCR检测 | 第48页 |
| ·T_1代转基因和野生型烟草的获得和筛选 | 第48页 |
| ·冷处理后T_1代转基因和野生型烟草存活率的测定 | 第48-49页 |
| ·冷处理后T_1代转基因和野生型烟草表型观测 | 第49页 |
| ·相对电导率的测定 | 第49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-65页 |
| ·PtrICE1基因的克隆及序列分析 | 第49-53页 |
| ·PtrICE1基因cDNA片段的克隆 | 第49页 |
| ·3' RACE | 第49页 |
| ·PtrICE1完整的ORF的克隆和分析 | 第49-53页 |
| ·冷和ABA处理后PtrICE1的表达模式 | 第53-55页 |
| ·冷胁迫下PtrICE1的表达模式 | 第53-54页 |
| ·ABA胁迫下PtrICE1的表达模式 | 第54-55页 |
| ·PtrICE1基因超表达载体的构建 | 第55-58页 |
| ·PtrICE1插入pMD18-T载体方向的确定 | 第55页 |
| ·双酶切pMDICE1和pMV的结果 | 第55-56页 |
| ·T4连接酶连接pMV载体大片段和目的基因小片段 | 第56-57页 |
| ·pMVICE1转化农杆菌 | 第57-58页 |
| ·烟草转基因植株的获得 | 第58-65页 |
| ·根癌农杆菌介导的烟草转化 | 第58-59页 |
| ·T_0代转基因烟草的PCR检测 | 第59-60页 |
| ·T_0代转基因烟草的半定量RT-PCR检测 | 第60-61页 |
| ·T_0代转基因烟草与野生型烟草的表型差异 | 第61-62页 |
| ·T_1代转基因烟草的获得和Km抗性筛选 | 第62页 |
| ·冷处理后T_1代转基因烟草与野生型烟草的膜透性差异 | 第62-63页 |
| ·冷处理后T_1代转基因烟草与野生型烟草的存活率差异 | 第63-64页 |
| ·冷处理后T_1代转基因烟草与野生型烟草的表型差异 | 第64-65页 |
| 4 讨论 | 第65-70页 |
| ·PtrICE1基因的克隆和序列分析 | 第65-66页 |
| ·PtrICE1基因的表达分析 | 第66-67页 |
| ·抗寒基因的选择 | 第67页 |
| ·转化模式植物验证PtrICE1基因功能 | 第67-68页 |
| ·转基因烟草的表型变化 | 第68-70页 |
| 第三章 枳PtrICE1基因上游启动子的克隆、分析和鉴定 | 第70-89页 |
| 1 材料和方法 | 第71页 |
| ·试验材料 | 第71页 |
| ·菌株与质粒载体 | 第71页 |
| ·酶与试剂盒 | 第71页 |
| ·引物合成 | 第71页 |
| 2 实验方法 | 第71-77页 |
| ·试验材料的准备 | 第71页 |
| ·枳PtrICE1基因上游启动子的克隆 | 第71-74页 |
| ·枳基因组DNA的提取 | 第71-72页 |
| ·PtrICE1基因DNA序列扩增 | 第72页 |
| ·PtrICE1基因启动子克隆 | 第72-74页 |
| ·PtrICE1启动子功能验证表达载体的构建 | 第74-76页 |
| ·根癌农杆菌介导的烟草遗传转化 | 第76-77页 |
| ·根癌农杆菌感受态的制备(CaCl_2法) | 第76页 |
| ·工程菌的制备 | 第76页 |
| ·试剂和培养基配制 | 第76-77页 |
| ·根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草 | 第77页 |
| ·转基因烟草Km抗性植株PCR检测 | 第77页 |
| ·GUS活性组织化学染色检测 | 第77页 |
| ·溶液配制 | 第77页 |
| ·胁迫处理 | 第77页 |
| ·GUS染色 | 第77页 |
| 3 结果与分析 | 第77-87页 |
| ·PtrICE1 DNA序列分析 | 第77-78页 |
| ·PtrICE1基因上游启动子序列克隆 | 第78-79页 |
| ·PtrICE1基因启动子上顺式元件预测 | 第79-81页 |
| ·PtrICE1启动子活性检测表达载体的构建 | 第81-84页 |
| ·启动子序列插入pMD18-T载体方向的确定 | 第81-82页 |
| ·部分酶切pMDPROICE1和双酶切pBI121的结果 | 第82-83页 |
| ·T4连接酶连接载体大片段和PtrICE1基因启动子片段 | 第83-84页 |
| ·pBIPROICE1:GUS转化农杆菌 | 第84页 |
| ·烟草转基因植株的获得 | 第84-85页 |
| ·根癌农杆菌介导的烟草转化 | 第84-85页 |
| ·T_0代转基因烟草的PCR检测 | 第85页 |
| ·冷处理后T_0代转基因烟草的GUS的组织化学染色 | 第85-87页 |
| 5 讨论 | 第87-89页 |
| 第四章 枳PtrHOS1基因的克隆及表达分析 | 第89-99页 |
| 1 材料和方法 | 第89-90页 |
| ·试验材料 | 第89页 |
| ·菌株与质粒载体 | 第89页 |
| ·酶与试剂盒 | 第89页 |
| ·引物合成 | 第89-90页 |
| 2 实验方法 | 第90-92页 |
| ·试验材料的准备 | 第90页 |
| ·枳PtrHOS1基因的克隆 | 第90-92页 |
| ·植物总RNA的抽提 | 第90页 |
| ·RNA质量检测与浓度测定 | 第90页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第90-91页 |
| ·PCR扩增获得PtrHOS1基因片段 | 第91页 |
| ·PCR产物的回收、纯化 | 第91页 |
| ·回收纯化的目的片段与克隆载体的连接 | 第91页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第91页 |
| ·连接产物的转化及重组质粒的蓝白斑筛选 | 第91页 |
| ·PtrHOS1基因片段测序 | 第91页 |
| ·3' RACE | 第91-92页 |
| ·序列拼接 | 第92页 |
| ·完整的ORF克隆 | 第92页 |
| ·生物信息学分析 | 第92页 |
| ·PtrHOS1在不同的逆境下的表达模式分析 | 第92页 |
| 3 结果与分析 | 第92-97页 |
| ·PtrHOS1基因的克隆及序列分析 | 第92-96页 |
| ·PtrHOS1基因cDNA片段的克隆 | 第92-93页 |
| ·3' RACE | 第93页 |
| ·PtrHOS1完整的ORF的克隆和分析 | 第93-96页 |
| ·冷和ABA处理后PtrHOS1的表达模式 | 第96-97页 |
| 4 讨论 | 第97-99页 |
| 第五章 枳PtrLOS2基因的克隆及表达分析 | 第99-109页 |
| 1 材料和方法 | 第99-100页 |
| ·试验材料 | 第99页 |
| ·菌株与质粒载体 | 第99页 |
| ·酶与试剂盒 | 第99页 |
| ·引物合成 | 第99-100页 |
| 2 实验方法 | 第100-102页 |
| ·试验材料的准备 | 第100页 |
| ·枳PtrLOS2基因的克隆 | 第100-102页 |
| ·植物总RNA的抽提 | 第100页 |
| ·RNA质量检测与浓度测定 | 第100页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第100页 |
| ·PCR扩增获得PtrLOS2基因片段 | 第100-101页 |
| ·PCR产物的回收、纯化 | 第101页 |
| ·回收纯化的目的片段与克隆载体的连接 | 第101页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第101页 |
| ·连接产物的转化及重组质粒的蓝白斑筛选 | 第101页 |
| ·PtrLOS2基因片段测序 | 第101页 |
| ·3' RACE | 第101页 |
| ·序列拼接 | 第101-102页 |
| ·完整的ORF克隆 | 第102页 |
| ·生物信息学分析 | 第102页 |
| ·PtrLOS2在不同的逆境下的表达模式分析 | 第102页 |
| 3 结果与分析 | 第102-107页 |
| ·PtrLOS2基因的克隆及序列分析 | 第102-106页 |
| ·PtrLOS2基因cDNA片段的克隆 | 第102-103页 |
| ·3' RACE | 第103页 |
| ·PtrLOS2完整的ORF的克隆和分析 | 第103-106页 |
| ·冷和ABA处理后PtrLOS2的表达模式 | 第106-107页 |
| ·冷处理后PtrLOS2的表达模式 | 第106页 |
| ·ABA处理后PtrLOS2的表达模式 | 第106-107页 |
| 4 讨论 | 第107-109页 |
| 参考文献 | 第109-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 附录 攻读博士学位期间发表论文 | 第128页 |
