| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 引言 | 第15-22页 |
| 0.1 阿尔茨海默病发病机制的各种假说 | 第15-17页 |
| 0.2 DHCR24及其神经保护作用 | 第17-18页 |
| 0.3 基因疗法以及腺病毒载体 | 第18-19页 |
| 0.4 细胞窖 | 第19-20页 |
| 0.5 Insulin/IGF-IRS-Akt信号转导通路 | 第20-21页 |
| 0.6 研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 第1章 重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24的扩增和纯化 | 第22-27页 |
| 1.1 引言 | 第22-23页 |
| 1.1.1 重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24 | 第22页 |
| 1.1.2 CsCl密度梯度离心法 | 第22-23页 |
| 1.2 实验材料 | 第23-24页 |
| 1.2.1 生化试剂耗材 | 第23页 |
| 1.2.2 主要仪器设备 | 第23页 |
| 1.2.3 试剂的配制 | 第23-24页 |
| 1.3 实验方法 | 第24-26页 |
| 1.3.1 Ad293细胞复苏、传代及冻存 | 第24-25页 |
| 1.3.1.1 Ad293细胞复苏 | 第24页 |
| 1.3.1.2 Ad293细胞传代 | 第24-25页 |
| 1.3.1.3 Ad293细胞冻存 | 第25页 |
| 1.3.2 对Ad293细胞进行腺病毒转染 | 第25-26页 |
| 1.3.3 CsCl密度梯度法获得高纯度重组腺病毒 | 第26页 |
| 1.3.4 腺病毒滴度测定 | 第26页 |
| 1.4 实验结果与讨论 | 第26页 |
| 1.5 结论 | 第26-27页 |
| 第2章 重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24对N2A细胞的保护作用 | 第27-43页 |
| 2.1 引言 | 第27-29页 |
| 2.1.1 衣霉素和过氧化氢 | 第27页 |
| 2.1.2 b淀粉样蛋白 | 第27-28页 |
| 2.1.3 免疫荧光技术 | 第28页 |
| 2.1.4 Westernblot技术 | 第28页 |
| 2.1.5 TUNEL | 第28页 |
| 2.1.6casepase-3 | 第28-29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-30页 |
| 2.2.1 生化试剂及耗材 | 第29-30页 |
| 2.2.2 试剂的配制 | 第30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-36页 |
| 2.3.1 重组腺病毒在N2A细胞中的表达确认 | 第30-34页 |
| 2.3.1.1 N2A细胞复苏、传代、冻存 | 第30-31页 |
| 2.3.1.2 细胞计数 | 第31-32页 |
| 2.3.1.3 对N2A细胞进行腺病毒转染 | 第32页 |
| 2.3.1.4 Westernblot检测转染情况 | 第32-34页 |
| 2.3.2 DHCR24过表达条件下Aβ刺激N2A实验 | 第34页 |
| 2.3.3 DHCR24过表达条件下H_2O_2刺激N2A实验 | 第34-35页 |
| 2.3.4 DHCR24过表达条件下衣霉素(TM)刺激N2A实验 | 第35页 |
| 2.3.5 TUNEL凋亡检测 | 第35页 |
| 2.3.6 免疫荧光法检测caspase-3的活性 | 第35-36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-42页 |
| 2.4.1 重组腺病毒能上调N2A细胞中DHCR24表达 | 第36-37页 |
| 2.4.2 Ad-hSYN1-DHCR24保护N2A细胞免于Aβ引起的细胞死亡 | 第37-38页 |
| 2.4.3 Ad-hSYN1-DHCR24保护N2A细胞免于H_2O_2引起的细胞死亡 | 第38-39页 |
| 2.4.4 Ad-hSYN1-DHCR24保护N2A细胞免于衣霉素引起的细胞死亡 | 第39-40页 |
| 2.4.5 Aβ及TM刺激下对细胞作用的TUNEL凋亡检测 | 第40-41页 |
| 2.4.6 caspase-3活性的检测结果 | 第41-42页 |
| 2.5 结论 | 第42-43页 |
| 第3章 Ad-hSYN1-DHCR24对大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞的保护作用 | 第43-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第43页 |
| 3.1.2 生化试剂耗材 | 第43-44页 |
| 3.1.3 试剂的配制 | 第44页 |
| 3.2 实验方法 | 第44-46页 |
| 3.2.1 重组腺病毒在大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞中的表达确认 | 第44-45页 |
| 3.2.1.1 大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞的获得 | 第44-45页 |
| 3.2.1.2 对大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞进行腺病毒转染 | 第45页 |
| 3.2.1.3 Westernblot检测转染情况 | 第45页 |
| 3.2.2 DHCR24过表达条件下Aβ刺激大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞实验 | 第45页 |
| 3.2.3 DHCR24过表达条件下H_2O_2刺激大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞实验 | 第45-46页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第46-49页 |
| 3.3.1 重组腺病毒能上调大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞中DHCR24过表达 | 第46-47页 |
| 3.3.2 Ad-hSYN1-DHCR24保护大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞免于Aβ引起的细胞死亡 | 第47-48页 |
| 3.3.3 Ad-hSYN1-DHCR24保护大鼠胚胎原代培养大脑皮质神经细胞免于H_2O_2引起的细胞死亡 | 第48-49页 |
| 3.4 结论 | 第49-50页 |
| 第4章 重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24对血清饥饿条件下改善IGF-1神经细胞保护作用的分子机制研究 | 第50-63页 |
| 4.1 引言 | 第50-51页 |
| 4.1.1 IGF-1 | 第50页 |
| 4.1.2 细胞内总胆固醇的测定 | 第50-51页 |
| 4.2 实验材料 | 第51-52页 |
| 4.2.1 试剂 | 第51页 |
| 4.2.2 主要仪器设备 | 第51页 |
| 4.2.3 试剂的配制 | 第51-52页 |
| 4.3 实验方法 | 第52-54页 |
| 4.3.1 免疫荧光检测血清饥饿条件下caspase-3活性 | 第52页 |
| 4.3.2 血清饥饿,IGF-1处理N2A细胞 | 第52页 |
| 4.3.3 TUNEL法检测细胞凋亡情况 | 第52页 |
| 4.3.4 Westernblot检测IGF-IRS-Akt信号转导通路 | 第52-53页 |
| 4.3.5 细胞内总胆固醇的测定 | 第53-54页 |
| 4.3.6 DHCR24过表达引起的细胞内胆固醇水平的升高对IGF-R在细胞窖中定位的确认 | 第54页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第54-61页 |
| 4.4.1 免疫荧光检测血清饥饿条件下caspase-3活性 | 第54-55页 |
| 4.4.2 DHCR24过表达能增强IGF-1的神经细胞保护作用 | 第55-56页 |
| 4.4.3 TUNEL法检测细胞凋亡情况 | 第56-57页 |
| 4.4.4 Westernblot检测IGF-IRS-Akt信号转导通路 | 第57-59页 |
| 4.4.5 细胞内总胆固醇的测定 | 第59-60页 |
| 4.4.6 Ad-hSYN1-DHCR24诱导的细胞内胆固醇水平的升高对IGF-R在细胞窖中定位的影响 | 第60-61页 |
| 4.5 结论 | 第61-63页 |
| 第5章 大鼠脑组织中重组腺病毒的表达确认及细胞窖确认研究 | 第63-71页 |
| 5.1 引言 | 第63页 |
| 5.1.1 脑立体定位仪 | 第63页 |
| 5.1.2 颞叶 | 第63页 |
| 5.2 实验材料 | 第63-64页 |
| 5.2.1 实验动物 | 第63页 |
| 5.2.2 实验试剂及耗材 | 第63-64页 |
| 5.2.3 主要仪器设备 | 第64页 |
| 5.2.4 试剂的配制 | 第64页 |
| 5.3 实验方法 | 第64-67页 |
| 5.3.1 大鼠大脑海马回中的表达确认 | 第64-66页 |
| 5.3.1.1 对SD大鼠侧脑室注射腺病毒 | 第64-65页 |
| 5.3.1.2 Westernblot检测转染情况 | 第65-66页 |
| 5.3.1.3 免疫荧光检测DHCR24表达情况 | 第66页 |
| 5.3.2 双重免疫荧光染色,检测大鼠脑组织中caveolin-1及IGF-R的表达情况 | 第66-67页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第67-70页 |
| 5.4.1 重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24能上调大鼠海马回区域DHCR24表达 | 第67-69页 |
| 5.4.2 IGF-1R在大鼠脑细胞窖定位的确认 | 第69-70页 |
| 5.5 结论 | 第70-71页 |
| 第6章 结果与展望 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-79页 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况 | 第79-80页 |
