| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 缩略词表 | 第10-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-31页 |
| 1.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶概述 | 第15-16页 |
| 1.2 蛇毒纤溶酶原激活剂概述 | 第16-17页 |
| 1.2.1 SV-PA的分子结构 | 第16页 |
| 1.2.2 SV-PA的理化性质 | 第16-17页 |
| 1.2.3 SV-PA的酶学性质 | 第17页 |
| 1.2.4 SV-PA的作用机制 | 第17页 |
| 1.3 蛇毒类凝血酶概述 | 第17-20页 |
| 1.3.1 SVTLE的分子结构 | 第18页 |
| 1.3.2 SVTLE的理化性质 | 第18-19页 |
| 1.3.3 SVTLE的作用机制 | 第19页 |
| 1.3.4 SVTLE的生物活性 | 第19-20页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统概述 | 第20-23页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统的组成 | 第20-22页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统前景 | 第22-23页 |
| 1.5 蛇毒蛋白糖基化与毕赤酵母表达外源蛋白糖基化比较 | 第23-27页 |
| 1.5.1 蛋白质糖基化简介 | 第23页 |
| 1.5.2 蛇毒糖蛋白 | 第23-25页 |
| 1.5.3 毕赤酵母表达外源蛋白的糖基化 | 第25-26页 |
| 1.5.4 毕赤酵母糖基化改造 | 第26-27页 |
| 1.6 蛇毒纤溶酶原激活剂和类凝血酶的异源表达 | 第27-29页 |
| 1.6.1 SV-PA的异源表达 | 第27页 |
| 1.6.2 SVTLE的异源表达 | 第27-29页 |
| 1.7 选题依据及实验技术路线 | 第29-31页 |
| 第2章 生物信息学分析及密码子优化 | 第31-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-32页 |
| 2.2.1 生物信息学分析 | 第31页 |
| 2.2.2 密码子优化 | 第31-32页 |
| 2.3 实验结果 | 第32-42页 |
| 2.3.1 生物信息学分析结果 | 第32-35页 |
| 2.3.2 密码子优化结果 | 第35-42页 |
| 2.4 讨论 | 第42-45页 |
| 2.4.1 生物信息学分析 | 第42-43页 |
| 2.4.2 密码子优化 | 第43-45页 |
| 第3章 真核表达载体的构建 | 第45-53页 |
| 3.1 材料 | 第45-46页 |
| 3.1.1 载体和菌株 | 第45页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第45页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第45-46页 |
| 3.2 实验方法 | 第46-49页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第46页 |
| 3.2.2 目的基因的获得 | 第46-47页 |
| 3.2.3 pPIC9K载体的获得 | 第47页 |
| 3.2.4 目的基因和pPIC9K载体的双酶切 | 第47页 |
| 3.2.5 目的基因和载体的连接 | 第47-48页 |
| 3.2.6 TOP10感受态的制备 | 第48页 |
| 3.2.7 转化 | 第48页 |
| 3.2.8 重组载体的鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3 实验结果 | 第49-51页 |
| 3.3.1 GI-PA1和Intobin2基因的PCR扩增 | 第49页 |
| 3.3.2 pPIC9K载体的双酶切结果 | 第49-50页 |
| 3.3.3 重组载体的鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4 讨论 | 第51-53页 |
| 第4章 重组载体电转化毕赤酵母及阳性转化子的筛选 | 第53-65页 |
| 4.1 实验材料 | 第53页 |
| 4.1.1 菌株 | 第53页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第53页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第53页 |
| 4.1.4 培养基配方 | 第53页 |
| 4.2 实验方法 | 第53-57页 |
| 4.2.1 重组载体的线性化 | 第53-54页 |
| 4.2.2 酵母感受态的制备 | 第54-55页 |
| 4.2.3 电转化毕赤酵母 | 第55页 |
| 4.2.4 毕赤酵母转化子的筛选 | 第55-56页 |
| 4.2.5 转化子的鉴定 | 第56-57页 |
| 4.2.6 重组蛋白的初步诱导及Western-blot鉴定 | 第57页 |
| 4.3 实验结果 | 第57-62页 |
| 4.3.1 重组载体的线性化结果 | 第57-58页 |
| 4.3.2 毕赤酵母的电转化 | 第58页 |
| 4.3.3 毕赤酵母转化子的筛选 | 第58-60页 |
| 4.3.4 酵母基因组PCR | 第60-61页 |
| 4.3.5 重组蛋白的初步诱导 | 第61-62页 |
| 4.3.6 重组蛋白的Western-blot鉴定 | 第62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-65页 |
| 第5章 重组菌的摇瓶水平发酵条件优化 | 第65-75页 |
| 5.1 实验材料 | 第65页 |
| 5.1.1 菌株 | 第65页 |
| 5.1.2 实验仪器 | 第65页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第65页 |
| 5.2 实验方法 | 第65-67页 |
| 5.2.1 蛋白浓度的测定 | 第65-66页 |
| 5.2.2 时间优化 | 第66页 |
| 5.2.3 pH优化 | 第66页 |
| 5.2.4 甲醇添加量优化 | 第66页 |
| 5.2.5 温度优化 | 第66-67页 |
| 5.2.6 添加抗氧化剂 | 第67页 |
| 5.2.7 数据分析 | 第67页 |
| 5.3 实验结果 | 第67-71页 |
| 5.3.1 蛋白浓度标准曲线的绘制 | 第67-68页 |
| 5.3.2 时间优化结果 | 第68-69页 |
| 5.3.3 pH优化 | 第69页 |
| 5.3.4 甲醇添加量 | 第69-70页 |
| 5.3.5 温度优化 | 第70-71页 |
| 5.3.6 添加抗氧化剂 | 第71页 |
| 5.4 讨论 | 第71-75页 |
| 第6章 重组蛋白的纯化及生物活性鉴定 | 第75-83页 |
| 6.1 实验材料 | 第75页 |
| 6.2 实验试剂 | 第75-77页 |
| 6.3 实验方法 | 第77-79页 |
| 6.3.1 目标蛋白的纯化 | 第77页 |
| 6.3.2 生物活性测定 | 第77-79页 |
| 6.4 讨论 | 第79-83页 |
| 第7章 总结与展望 | 第83-85页 |
| 7.1 总结 | 第83-84页 |
| 7.2 展望 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-95页 |
| 附录 | 第95-103页 |
| 致谢 | 第103-105页 |
| 攻读硕士期间研究成果 | 第105页 |
