| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第9-21页 |
| 1.1 马铃薯Y病毒属病毒概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 甜椒脉斑驳病毒(PVMV)症状表现 | 第10页 |
| 1.1.2 马铃薯Y病毒属基因组结构和功能研究 | 第10-12页 |
| 1.2 植物抗病毒基因工程研究 | 第12-13页 |
| 1.2.1 来源于病毒的抗性基因策略 | 第12-13页 |
| 1.2.2 非病毒基因来源的抗性策略研究 | 第13页 |
| 1.3 真核翻译起始因子的相关研究 | 第13-17页 |
| 1.3.1 真核翻译起始因子4E的结构 | 第13-14页 |
| 1.3.2 eIF4E参与真核生物蛋白质翻译的起始 | 第14-15页 |
| 1.3.3 eIF4E参与抗病毒的机制 | 第15-16页 |
| 1.3.4 马铃薯Y病毒属病毒与eIF4E家族成员的结合具有选择性 | 第16-17页 |
| 1.4 本研究的关键技术方法 | 第17-19页 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 | 第17-18页 |
| 1.4.2 荧光双分子互补技术 | 第18-19页 |
| 1.4.3 基因编辑技术 | 第19页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第19-20页 |
| 1.6 本研究的技术路线 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-39页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第21-23页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第21页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.1.3 表达载体 | 第21-22页 |
| 2.1.4 主要的酶和生化试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第23页 |
| 2.2 方法 | 第23-39页 |
| 2.2.1 黄灯笼辣椒样品叶片总RNA提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2 黄灯笼辣椒样品叶片cDNA合成 | 第24页 |
| 2.2.3 反转录产物可靠性检验 | 第24-25页 |
| 2.2.4 引物设计 | 第25页 |
| 2.2.5 PCR扩增程序 | 第25-26页 |
| 2.2.6 eIF4E家族4个基因目的片段回收纯化、连接、转化 | 第26页 |
| 2.2.7 酵母诱饵载体的构建 | 第26-28页 |
| 2.2.8 酵母激活域载体的构建 | 第28-30页 |
| 2.2.9 酵母双杂交(LexA系统)菌株EGY48 (p8op-LacZ)表型鉴定 | 第30页 |
| 2.2.10 重组激活域质粒转化EGY48(p8op-LacZ)酵母感受态细胞 | 第30页 |
| 2.2.11 转化酵母的菌落PCR鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.12 激活域质粒的自激活活性检测 | 第31页 |
| 2.2.13 激活域质粒的毒性检测 | 第31页 |
| 2.2.14 诱饵质粒转化EGY48 (p8op-LacZ)酵母感受态细胞 | 第31页 |
| 2.2.15 菌落PCR鉴定 | 第31页 |
| 2.2.16 诱饵质粒的自激活活性检测 | 第31页 |
| 2.2.17 诱饵质粒对EGY48酵母菌的毒性检测 | 第31-32页 |
| 2.2.18 诱饵质粒和激活域质粒同时转化EGY48 (p8op-LacZ)菌株 | 第32页 |
| 2.2.19 酵母菌株阳性克隆的筛选 | 第32页 |
| 2.2.20 酵母阳性克隆的验证 | 第32-33页 |
| 2.2.21 双分子荧光互补载体的构建 | 第33-36页 |
| 2.2.22 EHA105农杆菌感受态细胞制备 | 第36页 |
| 2.2.23 BiFC重组表达质粒转化农杆菌感受态细胞 | 第36-37页 |
| 2.2.24 注射烟草 | 第37-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-53页 |
| 3.1 黄灯笼辣椒eIF4E家族基因的克隆 | 第39-44页 |
| 3.1.1 黄灯笼辣椒嫩叶总RNA提取 | 第39页 |
| 3.1.2 黄灯笼辣椒eIF4E家族4个基因的克隆 | 第39-40页 |
| 3.1.3 黄灯笼辣椒eIF4E家族4个基因全长ORF分析 | 第40-44页 |
| 3.2 酵母双杂交鉴定蛋白互作结果 | 第44-49页 |
| 3.2.1 酵母双杂交激活域载体pB42AD-eIF4E/eIF(iso)4E/eIF4E-Xm/ nCBP9090的构建及鉴定 | 第44-45页 |
| 3.2.2 酵母双杂交诱饵载体pLexA-VPg的构建及鉴定 | 第45页 |
| 3.2.3 激活域载体的毒性及自激活活性检测 | 第45-46页 |
| 3.2.4 诱饵载体的毒性及自激活活性检测 | 第46-47页 |
| 3.2.5 酵母双杂交系统阳性克隆筛选 | 第47-48页 |
| 3.2.6 酵母双杂交系统阳性克隆的验证 | 第48-49页 |
| 3.3 双分子荧光互补技术进一步验证eIF4E家族因子与PVMV-VPg的互作 | 第49-53页 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 | 第49页 |
| 3.3.2 目的基因PCR扩增 | 第49-50页 |
| 3.3.3 双分子荧光互补表达载体的构建 | 第50页 |
| 3.3.4 重组质粒转化农杆菌EHA105 | 第50-51页 |
| 3.3.5 农杆菌注射烟草的蛋白互作检测 | 第51-53页 |
| 4 讨论 | 第53-57页 |
| 4.1 黄灯笼辣椒eIF4E家族成员的分析 | 第53页 |
| 4.2 黄灯笼辣椒Cc-eIF4E和Cc-eIF(iso)4E抗病位点的预测 | 第53-54页 |
| 4.3 Y2HS和BiFC研究黄灯笼辣椒eIF4E家族蛋白与PVMV-VPg之间的互作 | 第54-55页 |
| 4.4 以黄灯笼辣椒eIF4E为靶点进行基因编辑培育抗PVMV新品系的可行性 | 第55-57页 |
| 5 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-65页 |
| 附录 | 第65-68页 |
| 附录一 缩略词表 | 第65-66页 |
| 附录二 载体图谱 | 第66-68页 |
| 本研究获资助项目 | 第68页 |
| 发表文章 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
