| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第17-33页 |
| 1.1. 超长链单不饱和脂肪酸概述 | 第17-22页 |
| 1.1.1. 脂肪酸概述 | 第17页 |
| 1.1.2. 超长链单不饱和脂肪酸的制备 | 第17-22页 |
| 1.1.2.1. 芥酸和神经酸概述 | 第17-19页 |
| 1.1.2.2. 直接提取法 | 第19-20页 |
| 1.1.2.3. 化学合成法 | 第20-21页 |
| 1.1.2.4. 生物合成法 | 第21-22页 |
| 1.2. VLCMFA的生物合成途径及代谢工程 | 第22-25页 |
| 1.2.1. 脂肪酸的从头合成 | 第22-23页 |
| 1.2.2. 超长链单不饱和脂肪酸的合成途径 | 第23-24页 |
| 1.2.3. 芥酸和神经酸的代谢工程 | 第24-25页 |
| 1.3. 微生物油脂合成代谢的调控 | 第25-29页 |
| 1.3.1. 微生物油脂合成代谢的调控概述 | 第25-28页 |
| 1.3.1.1. 脂肪酸的合成 | 第25-26页 |
| 1.3.1.2. TAG的合成 | 第26-28页 |
| 1.3.2. 转录因子概述 | 第28页 |
| 1.3.3. 转录因子调控脂肪酸的合成 | 第28-29页 |
| 1.4. 课题研究目的与研究思路 | 第29-33页 |
| 1.4.1. 本课题的研究思路 | 第29-30页 |
| 1.4.2. 本课题的研究内容及意义 | 第30-33页 |
| 第二章 KCS和FAE1在VLCMFA生物合成中的作用 | 第33-61页 |
| 2.1. 引言 | 第33页 |
| 2.2. 实验材料与仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.1. 菌株及质粒 | 第33-34页 |
| 2.2.2. 培养基 | 第34页 |
| 2.3. 实验方法 | 第34-45页 |
| 2.3.1. YEplac112-P_(PGK)表达载体的构建 | 第34-38页 |
| 2.3.1.1. PGK启动子基因的克隆 | 第34-35页 |
| 2.3.1.2. 将PGK启动子片段连入YEplac112 | 第35-36页 |
| 2.3.1.3. 重组质粒转入大肠杆菌验证 | 第36页 |
| 2.3.1.4. 重组质粒的筛选 | 第36-38页 |
| 2.3.2. YEplac112-P_(PGK)-T_(CYC)表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.2.1. CYC终止子片段的克隆 | 第38页 |
| 2.3.2.2. 将CYC终止子片段连入YEplac112-P_(PGK)载体 | 第38-39页 |
| 2.3.2.3. YEplac112-P_(PGK)-T_(CYC)重组载体的筛选 | 第39页 |
| 2.3.3. P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)和P_(PGK)-KCS-T_(CYC)表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.3.1. 将FAE1和KCS分别连入YEplac112-P_(PGK)-T_(CYC)载体 | 第39-40页 |
| 2.3.3.2. P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)、和P_(PGK)-KCS-T_(CYC)载体的筛选 | 第40页 |
| 2.3.4. P_(GAL1)-FAE1-T_(CYC)、P_(GAL1)-KCS-T_(CYC)和P_(GAL1)-FAE1-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 2.3.4.1. FAE1和KCS基因的克隆 | 第40-41页 |
| 2.3.4.2. P_(GAL1)-FAE1-T_(CYC)和P_(GAL1)-KCS-T_(CYC)载体的构建 | 第41页 |
| 2.3.4.3. P_(GAL1)-FAE1-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.3.5. 基因工程菌在酿酒酵母中的筛选与表达 | 第42页 |
| 2.3.5.1. YS58感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 2.3.5.2. 重组酵母的筛选 | 第42页 |
| 2.3.6. 酿酒酵母油脂提取方法的比较 | 第42-45页 |
| 2.3.6.1. 超声波破壁提取酵母油脂 | 第43页 |
| 2.3.6.2. 真空冷冻干燥法提取酵母油 | 第43-44页 |
| 2.3.6.3. 烘干研磨提取酵母油脂 | 第44页 |
| 2.3.6.4. 皂化法提取酵母油脂 | 第44-45页 |
| 2.3.7. 基因工程菌的发酵 | 第45页 |
| 2.3.8. 超长链单不饱和脂肪酸的检测 | 第45页 |
| 2.4. 结果及分析 | 第45-58页 |
| 2.4.1. YEplac112-P_(PGK)载体的构建 | 第45-46页 |
| 2.4.2. YEplac112-P_(PGK)-T_(CYC)载体的构建 | 第46-47页 |
| 2.4.3. P_(PGK)-FAE1-T_(CTC)和P_(PGK)-KCS-T_(CYC)表达载体的构建 | 第47-49页 |
| 2.4.4. P_(GAL1)-FAE1-T_(CYC)、P_(GAL1)-KCS-T_(CYC)和P_(GAL1)-FAE1-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)载体的构建 | 第49-51页 |
| 2.4.5. 酿酒酵母汕脂提取方法的比较 | 第51-52页 |
| 2.4.6. 不同类型的启动子对超长链单不饱和脂肪酸合成的影响 | 第52-56页 |
| 2.4.6.1. 不同基因工程菌生长曲线的测定 | 第53页 |
| 2.4.6.2. 不同类型启动子驱动FAE1表达对工程菌脂肪酸组成的影响 | 第53-55页 |
| 2.4.6.3. 不同类型启动子驱动KCS表达对工程菌脂肪酸组成的影响 | 第55-56页 |
| 2.4.7. 异源表达KCS和FAE1对酵母VLCMFA合成的影响 | 第56-58页 |
| 2.5. 小结 | 第58-61页 |
| 第三章 多基因组合对VLCMFA合成的影响 | 第61-75页 |
| 3.1. 引言 | 第61页 |
| 3.2. 实验材料与仪器 | 第61-62页 |
| 3.2.1. 菌株与质粒 | 第61-62页 |
| 3.2.2. 培养基 | 第62页 |
| 3.3. 实验方法 | 第62-66页 |
| 3.3.1. P_(TEF1)-pYES2-T_(CYC)载体的构建 | 第62页 |
| 3.3.2. KCS-T_(CYC)与P_(PGK)-FAE1片段的无缝连接 | 第62-64页 |
| 3.3.3. P_(TEF1)-KCS-T_(CYC)-P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)双基因工程菌的构建 | 第64页 |
| 3.3.4. P_(TEF1)-Mga2-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)基因工程菌构建 | 第64-65页 |
| 3.3.5. P_(TEF1)-Mga2-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)-P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)三基因工程菌的构建 | 第65-66页 |
| 3.4. 结果及分析 | 第66-73页 |
| 3.4.1. P_(TEF1)-KCS-T_(CYC)-P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)双基因工程菌的构建 | 第66-68页 |
| 3.4.1.1. KCS-T_(CYC)与P_(PGK)-FAE1无缝连接 | 第66-67页 |
| 3.4.1.2. P_(TEF1)-KCS-T_(CYC)-P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)双基因工程菌的构建 | 第67-68页 |
| 3.4.2. P_(TEF1)-Mga2-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)基因工程菌的构建 | 第68-69页 |
| 3.4.3. P_(TEF1)-Mga2-T_(CYC)-P_(PGK)-KCS-T_(CYC)-P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)三基因工程菌的构建 | 第69-70页 |
| 3.4.4. 基因工程菌的发酵及油脂成分分析 | 第70-72页 |
| 3.4.5. 外源添加油酸对P_(TEF1)-KCS-T_(CYC)-P_(PGK)-FAE1-T_(CYC)工程菌产VLCMFA的影响 | 第72-73页 |
| 3.5. 小结 | 第73-75页 |
| 第四章 基因工程菌产VLCMFA培养条件的优化 | 第75-91页 |
| 4.1. 引言 | 第75页 |
| 4.2. 实验材料与仪器 | 第75页 |
| 4.2.1. 发酵菌株 | 第75页 |
| 4.2.2. 培养基 | 第75页 |
| 4.3. 实验方法 | 第75-76页 |
| 4.3.1. 菌种的活化 | 第75-76页 |
| 4.3.2. 外源添加物母液的配制 | 第76页 |
| 4.4. 结果与分析 | 第76-89页 |
| 4.4.1. 外源添加物单因素的选择 | 第76-81页 |
| 4.4.1.1. 外源添加不同脂肪酸对VLCMFA合成的影响 | 第76-78页 |
| 4.4.1.2. 外源添加苹果酸和柠檬酸对VLCMFA合成的影响 | 第78-80页 |
| 4.4.1.3. 外源添加生物素对VLCMFA合成的影响 | 第80-81页 |
| 4.4.2. 外源添加物单因素的优化 | 第81-86页 |
| 4.4.2.1. 外源添加不同浓度油酸对VLCMFA合成的影响 | 第81-83页 |
| 4.4.2.2. 外源添加不同浓度的苹果酸对VLCMFA合成的影响 | 第83-84页 |
| 4.4.2.3. 外源添加不同浓度的生物素对VLCMFA合成的影响 | 第84-86页 |
| 4.4.3. 培养温度对VLCMFA合成的影响 | 第86-87页 |
| 4.4.4. 培养时间对VLCMFA合成的影响 | 第87-89页 |
| 4.5. 小结 | 第89-91页 |
| 第五章 结论与展望 | 第91-93页 |
| 5.1. 结论 | 第91页 |
| 5.2 问题与展望 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-101页 |
| 附录一 本实验所使用实验材料 | 第101-103页 |
| 附录二 本实验所使用实验仪器 | 第103-105页 |
| 致谢 | 第105-107页 |
| 作者及导师简介 | 第107-108页 |
| 附件 | 第108-109页 |
