| 缩略语说明 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-12页 |
| Abstract | 第12-16页 |
| 第1章 综述 | 第17-33页 |
| 1.1 真菌天然产物生物合成研究进展 | 第17-19页 |
| 1.2 真菌聚酮-萜杂合类天然产物生物合成研究进展 | 第19-23页 |
| 1.3 霉酚酸生物活性 | 第23-24页 |
| 1.4 霉酚酸衍生物及成药性 | 第24-28页 |
| 1.4.1 霉酚酸结构修饰与活性的关系 | 第24-25页 |
| 1.4.2 基于霉酚酸结构中其他基团改造的衍生物 | 第25-26页 |
| 1.4.3 基于霉酚酸侧链改造的衍生物 | 第26-28页 |
| 1.5 霉酚酸的生物合成研究进展 | 第28-30页 |
| 1.6 本课题的提出及研究意义 | 第30-33页 |
| 第2章 材料与方法 | 第33-53页 |
| 2.1 本课题实验材料 | 第33-39页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第33-35页 |
| 2.1.2 主要试剂、缓冲液及其配制方法 | 第35-37页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第37-38页 |
| 2.1.4 主要培养基及其配制方法 | 第38页 |
| 2.1.5 序列获得及引物合成 | 第38-39页 |
| 2.2 本课题主要实验方法 | 第39-53页 |
| 2.2.1 灰黄青霉菌中霉酚酸基因簇分析 | 第39-40页 |
| 2.2.2 灰黄青霉菌孢子和菌体收集 | 第40页 |
| 2.2.3 灰黄青霉菌基因组的提取 | 第40页 |
| 2.2.4 灰黄青霉菌RNA的提取与纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.5 灰黄青霉菌cDNA合成 | 第41-42页 |
| 2.2.6 PCR体系 | 第42-43页 |
| 2.2.7 大肠杆菌中质粒的提取 | 第43-44页 |
| 2.2.8 质粒及PCR产物酶切和纯化 | 第44-45页 |
| 2.2.9 重组质粒构建 | 第45页 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| 2.2.11 大肠杆菌转化 | 第46页 |
| 2.2.12 酿酒酵母感受态的制备及转化 | 第46页 |
| 2.2.13 重组蛋白在E.coli中表达与纯化 | 第46-47页 |
| 2.2.14 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第47页 |
| 2.2.15 靶向基因敲除原理 | 第47-48页 |
| 2.2.16 灰黄青霉菌原生质体制备及转化 | 第48-49页 |
| 2.2.17 敲除株鉴定 | 第49-50页 |
| 2.2.18 化合物分子量确认 | 第50页 |
| 2.2.19 化合物分离及结构鉴定 | 第50页 |
| 2.2.20 体内生物转化 | 第50-51页 |
| 2.2.21 酵母微粒体提取 | 第51页 |
| 2.2.22 生物信息学分析 | 第51-53页 |
| 第3章 结果与分析 | 第53-83页 |
| 3.1 灰黄青霉菌中霉酚酸生物合成基因簇分析 | 第53页 |
| 3.2 霉酚酸生物合成途径预测 | 第53-54页 |
| 3.3 基因敲除载体构建 | 第54-55页 |
| 3.3.1 总gDNA提取 | 第54页 |
| 3.3.2 cDNA的合成 | 第54-55页 |
| 3.3.3 靶向基因敲除载体构建 | 第55页 |
| 3.4 灰黄青霉菌野生型菌株抗性测试 | 第55-56页 |
| 3.5 灰黄青霉菌原生质体制备 | 第56-57页 |
| 3.6 MpaA的功能验证 | 第57-66页 |
| 3.6.1 MpaA特性及功能分析 | 第57-58页 |
| 3.6.2 MpaA敲除突变株积累中间产物DHMP | 第58-61页 |
| 3.6.3 DHMP参与MPA的生物合成 | 第61-62页 |
| 3.6.4 MpaA催化DHMP转化为FDHMP | 第62-64页 |
| 3.6.5 MpaA体外酶学表征 | 第64-66页 |
| 3.7 MpaH的功能验证 | 第66-69页 |
| 3.7.1 MpaH敲除株积累产物102和103 | 第66-68页 |
| 3.7.2 化合物102和103不参与MPA生物合成 | 第68-69页 |
| 3.8 MpaB的功能验证 | 第69-83页 |
| 3.8.1 MpaB敲除株积累中间产物FDHMP和104 | 第69-73页 |
| 3.8.2 MpaB催化FDHMP和104体内生物转化 | 第73-74页 |
| 3.8.3 MpaB催化FDHMP同时产生105和106 | 第74-75页 |
| 3.8.4 化合物105和106的分离及结构鉴定 | 第75-77页 |
| 3.8.5 化合物105和106参与MPA的生物合成 | 第77-78页 |
| 3.8.6 MpaB催化FDHMP侧链断裂机制预测 | 第78-80页 |
| 3.8.7 MpaB催化底物宽泛性实验 | 第80-83页 |
| 第4章 讨论 | 第83-87页 |
| 4.1 丝状真菌膜依赖的异戊烯基转移酶MpaA | 第83-84页 |
| 4.2 α/β-水解酶MpaH可能不参与MPA生物合成 | 第84-85页 |
| 4.3 MpaB催化烯烃C-C双键氧化断裂 | 第85-87页 |
| 第5章 总结 | 第87-91页 |
| 5.1 总结 | 第87页 |
| 5.2 创新点 | 第87-88页 |
| 5.3 不足与展望 | 第88-91页 |
| 参考文献 | 第91-99页 |
| 附录 本课题所鉴定化合物的MS和核磁谱图 | 第99-111页 |
| 硕士期间发表论文及获奖情况 | 第111-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
