| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 绪论 | 第11-25页 |
| 1.1 课题来源及研究背景和意义 | 第11-12页 |
| 1.1.1 课题来源 | 第11页 |
| 1.1.2 研究背景和意义 | 第11-12页 |
| 1.2 细菌CRISPR-Cas系统的研究进展 | 第12-17页 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas系统的组成 | 第12页 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas系统的作用机理 | 第12-13页 |
| 1.2.3 CRISPR-Cas系统的分型 | 第13-14页 |
| 1.2.4 嗜热链球菌中的CRISPR-Cas系统 | 第14-17页 |
| 1.3 同源重组法构建突变体概述 | 第17-18页 |
| 1.3.1 自杀性载体介导的同源重组 | 第17页 |
| 1.3.2 温敏型载体介导的同源重组 | 第17-18页 |
| 1.4 CRISPRs基因编辑技术研究进展 | 第18-22页 |
| 1.4.1 CRISPR基因编辑技术 | 第18-20页 |
| 1.4.2 利用gRNA-Cas9进行基因编辑的影响因素 | 第20-21页 |
| 1.4.3 CRISPR基因编辑技术的优势 | 第21-22页 |
| 1.5 嗜热链球菌中双组分信号转导系统研究进展 | 第22-23页 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 | 第23-25页 |
| 1.6.1 嗜热链球菌中的CRISPRs分布 | 第23页 |
| 1.6.2 常规同源重组法敲除载体的构建 | 第23页 |
| 1.6.3 CRISPR-Cas9技术敲除载体的构建 | 第23-24页 |
| 1.6.4 本课题的研究路线 | 第24-25页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第25-41页 |
| 2.1 材料及仪器 | 第25-27页 |
| 2.1.1 试剂与材料 | 第25-26页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第26-27页 |
| 2.2 S.thermophilus中CRISPRs-Cas系统的分布 | 第27-32页 |
| 2.2.1 嗜热链球菌基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.2 嗜热链球菌CRISPR序列的扩增及纯化 | 第28-30页 |
| 2.2.3 目的片段的连接及转化 | 第30-31页 |
| 2.2.4 CRISPR及cas序列的测序及分析 | 第31-32页 |
| 2.3 基因敲除型突变体的构建 | 第32-35页 |
| 2.3.1 pRV300质粒的提取 | 第32-33页 |
| 2.3.2 pRV300质粒酶切位点的单酶切验证 | 第33页 |
| 2.3.3 PCR扩增关键TCSs的上下游片段及产物纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.4 外源片段和载体的双酶切 | 第34页 |
| 2.3.5 连接与转化 | 第34页 |
| 2.3.6 转化子验证 | 第34-35页 |
| 2.4 pCasSth基因编辑载体的构建 | 第35-38页 |
| 2.4.1 pCasSth构建所需片段的扩增 | 第35页 |
| 2.4.2 pCasSth片段序列的测序验证 | 第35-36页 |
| 2.4.3 pCasSth片段的酶切与纯化 | 第36页 |
| 2.4.4 金门组装构建pCasSth载体 | 第36-38页 |
| 2.5 TCSs基因敲除型pCasSth载体的构建 | 第38-41页 |
| 2.5.1 间隔子整合于pCasSth载体 | 第38-39页 |
| 2.5.2 靶基因上下游片段的连接 | 第39-41页 |
| 第3章 嗜热链球菌中CRISPRs分布 | 第41-55页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 S.thermophilus中CRISPRs位点的分布 | 第41-50页 |
| 3.2.1 基因组DNA的提取 | 第41-42页 |
| 3.2.2 PCR扩增22株嗜热链球菌中的CRISPR位点 | 第42-43页 |
| 3.2.3 22株嗜热链球菌的CRISPR序列测序结果 | 第43-44页 |
| 3.2.4 重复序列二级结构预测及差异性分析 | 第44-46页 |
| 3.2.5 间隔子的同源性及多样性分析 | 第46-50页 |
| 3.3 cas基因的序列信息及系统发育分析 | 第50-54页 |
| 3.3.1 cas基因序列分析 | 第50-51页 |
| 3.3.2 cas基因的系统发育分析 | 第51-54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第4章 常规同源重组法敲除载体的构建 | 第55-67页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 pRV300重组质粒的构建 | 第55-65页 |
| 4.2.1 pRV300质粒的提取及酶切位点验证 | 第55-57页 |
| 4.2.2 上下游片段的扩增及纯化 | 第57页 |
| 4.2.3 上下游片段及pRV300质粒的双酶切 | 第57-59页 |
| 4.2.4 上下游片段的连接、转化及筛选 | 第59-65页 |
| 4.3 本章小结 | 第65-67页 |
| 第5章 CRISPR-Cas9基因编辑载体的构建 | 第67-79页 |
| 5.1 引言 | 第67页 |
| 5.2 pCasSth质粒的构建 | 第67-74页 |
| 5.2.1 pCasSth空载体构建所需片段的设计与扩增 | 第68-70页 |
| 5.2.2 pCasSth部分序列的检测及验证 | 第70-71页 |
| 5.2.3 片段的酶切与纯化 | 第71-72页 |
| 5.2.4 pCasSth载体的组装 | 第72-74页 |
| 5.3 CRISPR基因编辑载体的构建 | 第74-78页 |
| 5.3.1 间隔子片段的连接 | 第74-75页 |
| 5.3.2 目的基因上下游片段的连接 | 第75-78页 |
| 5.4 本章小结 | 第78-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-87页 |
| 附录 | 第87-93页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果 | 第93-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
