| 摘要 | 第3-6页 |
| abstract | 第6-9页 |
| 缩略语表 | 第16-18页 |
| 1 前言 | 第18-44页 |
| 1.1 卵子发生和卵泡发育 | 第19-20页 |
| 1.2 卵母细胞成熟 | 第20-30页 |
| 1.2.1 卵母细胞体内成熟 | 第21-25页 |
| 1.2.2 卵母细胞体外成熟 | 第25-27页 |
| 1.2.3 卵母细胞体外成熟的探索 | 第27-30页 |
| 1.3 C型利钠肽概述 | 第30-33页 |
| 1.3.1 C型利钠肽的结构与生物学功能 | 第30-31页 |
| 1.3.2 C型利钠肽的作用机制 | 第31-32页 |
| 1.3.3 C型利钠肽对减数分裂的影响 | 第32-33页 |
| 1.4 线粒体氧化应激 | 第33-37页 |
| 1.4.1 线粒体活性氧的产生 | 第33-35页 |
| 1.4.2 线粒体氧化损伤 | 第35页 |
| 1.4.3 线粒体DNA氧化损伤 | 第35-36页 |
| 1.4.4 线粒体蛋白和脂质氧化损伤 | 第36页 |
| 1.4.5 线粒体呼吸链氧化损伤 | 第36-37页 |
| 1.5 P66Shc基因的概述 | 第37-41页 |
| 1.5.1 p66Shc基因的结构与生物学功能 | 第37-38页 |
| 1.5.2 p66Shc基因对线粒体氧化应激的调控 | 第38-40页 |
| 1.5.3 p66Shc对线粒体氧化应激的作用机制 | 第40-41页 |
| 1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容 | 第41-44页 |
| 1.6.1 本研究的目的和意义 | 第41-42页 |
| 1.6.2 本研究的主要内容 | 第42-44页 |
| 2 实验一C型利钠肽构建绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟培养体系 | 第44-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第44-47页 |
| 2.1.1 实验样品 | 第44-45页 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 | 第45页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第45-46页 |
| 2.1.4 主要工作液的配制 | 第46-47页 |
| 2.2 实验方法 | 第47-49页 |
| 2.2.1 卵母细胞的采集 | 第47页 |
| 2.2.2 CNP预孵育和卵母细胞体外成熟 | 第47页 |
| 2.2.3 卵母细胞减数分裂进程的评估 | 第47-48页 |
| 2.2.4 体外受精和体外培养 | 第48页 |
| 2.2.5 总RNA提取和cDNA合成 | 第48页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR | 第48-49页 |
| 2.2.7 TUNEL分析 | 第49页 |
| 2.2.8 线粒体染色 | 第49页 |
| 2.2.9 统计分析 | 第49页 |
| 2.3 结果 | 第49-55页 |
| 2.3.1 CNP预孵育延迟减数分裂进程的恢复 | 第49-51页 |
| 2.3.2 NPR2的表达 | 第51-52页 |
| 2.3.3 CNP预孵育提高了绵羊卵母细胞的发育能力 | 第52页 |
| 2.3.4 囊胚的细胞凋亡 | 第52-53页 |
| 2.3.5 线粒体分布 | 第53-55页 |
| 2.4 讨论 | 第55-56页 |
| 2.5 结论 | 第56-58页 |
| 3 实验二P66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系 | 第58-69页 |
| 3.1 材料与方法 | 第58-59页 |
| 3.1.1 实验样品 | 第58-59页 |
| 3.1.2 主要试剂与药品 | 第59页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第59页 |
| 3.2 试验方法 | 第59-61页 |
| 3.2.1 卵母细胞的采集与体外成熟 | 第59页 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR | 第59-60页 |
| 3.2.3 线粒体染色和细胞免疫荧光 | 第60页 |
| 3.2.4 ROS检测 | 第60页 |
| 3.2.5 氧化还原稳态检测 | 第60-61页 |
| 3.2.6 过氧化氢诱导处理 | 第61页 |
| 3.2.7 统计分析 | 第61页 |
| 3.3 结果 | 第61-67页 |
| 3.3.1 p66Shc在成熟前后不同质量卵母细胞中的相对表达量 | 第61-62页 |
| 3.3.2 p66Shc蛋白与线粒体在成熟前后不同质量卵母细胞的共定位 | 第62-64页 |
| 3.3.3 成熟前后不同质量卵母细胞的ROS水平 | 第64页 |
| 3.3.4 成熟前后不同质量绵羊卵母细胞的氧化还原稳态 | 第64-65页 |
| 3.3.5 过氧化氢诱导的氧化应激上调p66Shc的表达 | 第65-67页 |
| 3.4 讨论 | 第67-68页 |
| 3.5 结论 | 第68-69页 |
| 4 实验三P66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的表达和空间定位模式 | 第69-77页 |
| 4.1 材料与方法 | 第69-70页 |
| 4.1.1 实验样品 | 第69-70页 |
| 4.1.2 主要试剂与药品 | 第70页 |
| 4.1.3 主要仪器设备 | 第70页 |
| 4.2 试验方法 | 第70-71页 |
| 4.2.1 卵母细胞的收集和体外成熟 | 第70页 |
| 4.2.2 体外受精和体外培养 | 第70-71页 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR | 第71页 |
| 4.2.4 免疫荧光染色和共聚焦分析 | 第71页 |
| 4.2.5 统计分析 | 第71页 |
| 4.3 结果 | 第71-75页 |
| 4.3.1 p66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的表达和空间定位模式 | 第71-72页 |
| 4.3.2 p66Shc及36位丝氨酸(Ser-36)磷酸化的p66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的空间定位模式 | 第72-75页 |
| 4.4 讨论 | 第75-76页 |
| 4.5 结论 | 第76-77页 |
| 5 实验四p66Shc参与绵羊植入前胚胎发育过程中H_2O_2诱导的胞质氧化应激 | 第77-92页 |
| 5.1 材料与方法 | 第78页 |
| 5.1.1 实验样品 | 第78页 |
| 5.1.2 主要试剂与药品 | 第78页 |
| 5.1.3 主要仪器设备 | 第78页 |
| 5.2 试验方法 | 第78-80页 |
| 5.2.1 卵母细胞的体外成熟、体外受精、体外培养 | 第78-79页 |
| 5.2.2 实时定量RT-PCR | 第79页 |
| 5.2.3 氧化应激和抗氧化处理 | 第79页 |
| 5.2.4 免疫荧光染色和共聚焦分析 | 第79页 |
| 5.2.5 氧化还原稳态监测 | 第79-80页 |
| 5.2.6 TUNEL分析 | 第80页 |
| 5.2.7 检测ROS水平 | 第80页 |
| 5.2.8 统计分析 | 第80页 |
| 5.3 结果 | 第80-90页 |
| 5.3.1 早期植入前胚胎第一次卵裂的时间影响胚胎的发育能力和囊胚的形成 | 第80-82页 |
| 5.3.2 早期胚胎质量差伴随着p66Shc表达上调和线粒体功能的下降 | 第82-84页 |
| 5.3.3 p66Shc参与过氧化氢诱导的氧化应激 | 第84-86页 |
| 5.3.4 H_2O_2诱导的氧化应激促使p66Shc的36位丝氨酸磷酸化 | 第86-90页 |
| 5.4 讨论 | 第90-91页 |
| 5.5 结论 | 第91-92页 |
| 6 实验五siRNA靶向干扰p66Shc基因对绵羊早期胚胎发育潜能的影响 | 第92-104页 |
| 6.1 材料和方法 | 第92-93页 |
| 6.1.1 实验样品 | 第92-93页 |
| 6.1.2 主要试剂与药品 | 第93页 |
| 6.1.3 主要仪器设备 | 第93页 |
| 6.2 试验方法 | 第93-95页 |
| 6.2.1 卵母细胞收集和体外成熟 | 第93页 |
| 6.2.2 体外受精和体外培养 | 第93-94页 |
| 6.2.3 显微注射 | 第94页 |
| 6.2.4 RT-qPCR | 第94页 |
| 6.2.5 ROS检测 | 第94页 |
| 6.2.6 p66Shc免疫荧光检测 | 第94-95页 |
| 6.2.7 8-OHdG检测 | 第95页 |
| 6.2.8 统计分析 | 第95页 |
| 6.3 结果 | 第95-101页 |
| 6.3.1 评价合子阶段显微注射siRNA靶向干扰p66Shc基因的效率 | 第95-99页 |
| 6.3.2 p66Shc基因干扰提高绵羊胚胎的发育潜能 | 第99-100页 |
| 6.3.3 p66Shc基因干扰降低ROS的产生 | 第100页 |
| 6.3.4 p66Shc基因干扰降低氧化应激标记物8-OHdG的产生 | 第100-101页 |
| 6.4 讨论 | 第101-103页 |
| 6.5 结论 | 第103-104页 |
| 7 全文总体结论、创新点 | 第104-105页 |
| 7.1 总体结论 | 第104页 |
| 7.2 创新点 | 第104-105页 |
| 8 附录 | 第105-106页 |
| 8.1 附表 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-132页 |
| 作者简介 | 第132-134页 |
