| 缩略词表 | 第4-8页 |
| 中文摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1 前言 | 第11-18页 |
| 1.1 烟草丛顶病毒 | 第11-12页 |
| 1.2 RNA病毒基因组的表达策略 | 第12-15页 |
| 1.3 RNA病毒的基因组复制 | 第15-16页 |
| 1.4 本研究的研究目的和意义 | 第16-18页 |
| 2 材料和方法 | 第18-34页 |
| 2.1 材料 | 第18页 |
| 2.1.1 质粒、菌株、植物种子 | 第18页 |
| 2.1.2 感病叶片 | 第18页 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 | 第18页 |
| 2.1.4 主要试验仪器 | 第18页 |
| 2.1.5 引物 | 第18页 |
| 2.2 方法 | 第18-34页 |
| 2.2.1 质粒小量提取(碱裂解法) | 第18-19页 |
| 2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) | 第19-20页 |
| 2.2.3 重叠延伸PCR | 第20页 |
| 2.2.4 核酸的沉淀及浓缩 | 第20-21页 |
| 2.2.5 质粒或片段的酶切 | 第21页 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的回收 | 第21-22页 |
| 2.2.7 连接反应 | 第22页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)Rosetta制备 | 第22-23页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)Rosetta的转化 | 第23页 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选重组质粒 | 第23页 |
| 2.2.11 原核表达 | 第23-24页 |
| 2.2.12 原核表达产物的可溶性检测 | 第24页 |
| 2.2.13 可溶性蛋白的Ni-NTA Resin亲和层析纯化(His标签) | 第24-25页 |
| 2.2.14 可溶性蛋白的Amylose Resin亲和柱层析纯化(MBP标签) | 第25页 |
| 2.2.15 蛋白的切胶纯化 | 第25-26页 |
| 2.2.16 抗血清的制备 | 第26页 |
| 2.2.17 间接ELISA测效价 | 第26-27页 |
| 2.2.18 抗原亲和纯化 | 第27页 |
| 2.2.19 Western Blot分析 | 第27-28页 |
| 2.2.20 体外转录制备RNA | 第28-29页 |
| 2.2.21 体外翻译及检测 | 第29页 |
| 2.2.22 原生质体的侵染 | 第29-32页 |
| 2.2.23 RdRp介导的体外复制实验 | 第32-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-57页 |
| 3.1 TBTV复制酶的移码翻译机制的定量研究体系的创建 | 第34-49页 |
| 3.1.1 TBTV ORF1蛋白多克隆抗体的制备 | 第34-39页 |
| 3.1.1.1 TBTV ORF1原核表达载体的构建 | 第34页 |
| 3.1.1.2 TBTV ORF1的原核表达及纯化 | 第34-36页 |
| 3.1.1.3 TBTV ORF1抗血清的制备、效价测定以及免疫原性分析 | 第36-37页 |
| 3.1.1.4 TBTV ORF1抗血清的抗原亲和纯化 | 第37-38页 |
| 3.1.1.5 TBTV ORF1多抗的应用性分析 | 第38-39页 |
| 3.1.2 TBTV ORF2移码翻译机制的定性 | 第39-40页 |
| 3.1.3 海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)多克隆抗体的制备 | 第40-44页 |
| 3.1.3.1 Rluc原核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.1.3.2 Rluc蛋白的原核表达及纯化 | 第41-42页 |
| 3.1.3.3 Rluc抗血清的制备、效价测定以及免疫原性分析 | 第42-43页 |
| 3.1.3.4 Rluc抗血清的抗原亲和纯化 | 第43-44页 |
| 3.1.3.5 Rluc多抗的应用性分析 | 第44页 |
| 3.1.4 TBTV移码翻译机制的定量研究体系的初步创建 | 第44-49页 |
| 3.2 TBTV RdRp介导的体外复制研究体系的创建 | 第49-54页 |
| 3.2.1 TBTV RdRp的获得 | 第49-53页 |
| 3.2.1.1 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白的原核表达载体构建 | 第49-51页 |
| 3.2.1.2 TBTVORF1/ORF2融合蛋白的原核表达及可溶性分析 | 第51-53页 |
| 3.2.2 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白介导的体外复制体系的创建 | 第53-54页 |
| 3.2.2.1 RNA模板的制备 | 第53-54页 |
| 3.2.2.2 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白介导的体外复制体系的初试 | 第54页 |
| 3.3 其它工作 | 第54-57页 |
| 3.3.1 TBTV ORF3和ORF4蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 3.3.2 涉及TBTV ORF2移码定量研究的缺失突变载体的构建 | 第55-57页 |
| 4 讨论 | 第57-59页 |
| 4.1 关于原核表达 | 第57页 |
| 4.2 关于抗血清/多克隆抗体的制备 | 第57页 |
| 4.3 关于TBTV ORF2的移码翻译机制定性及定量研究体系的创建 | 第57-58页 |
| 4.4 关于TBTV RdRp介导的基因组复制的研究体系的创建 | 第58-59页 |
| 5 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附表1 引物列表 | 第66-69页 |
| 附表2 质粒列表 | 第69-75页 |
