| 英文缩略词及中文对照表 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-23页 |
| 1.1 纤维素的概述 | 第13-14页 |
| 1.1.1 纤维素的组成 | 第13页 |
| 1.1.2 纤维素的降解 | 第13-14页 |
| 1.2 纤维素酶的概述 | 第14-19页 |
| 1.2.1 纤维素酶的定义及分类 | 第14页 |
| 1.2.2 纤维素酶的结构 | 第14-16页 |
| 1.2.3 纤维素酶的降解机制 | 第16-17页 |
| 1.2.4 纤维素酶的应用 | 第17页 |
| 1.2.5 纤维素酶基因的克隆及分子改造 | 第17-19页 |
| 1.3 嗜热真菌的概述 | 第19-20页 |
| 1.3.1 嗜热真菌的定义及研究概况 | 第19-20页 |
| 1.3.2 嗜热真菌的应用 | 第20页 |
| 1.4 研究目的、内容及技术路线 | 第20-23页 |
| 1.4.1 研究目的 | 第20-21页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第21-22页 |
| 1.4.3 技术路线 | 第22-23页 |
| 2 实验材料与方法 | 第23-49页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第23页 |
| 2.1.2 酶与实验试剂 | 第23页 |
| 2.1.3 培养基及溶液的配制 | 第23-25页 |
| 2.1.3.1 培养基的配制 | 第23-24页 |
| 2.1.3.2 溶液的配制 | 第24-25页 |
| 2.2 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶cbh1基因的真核表达 | 第25-37页 |
| 2.2.1 外切葡聚糖酶cbh1基因的克隆 | 第25-29页 |
| 2.2.1.1 嗜热毁丝菌总RNA的提取 | 第25页 |
| 2.2.1.2 cbh1基因的扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.1.3 PCR产物的回收 | 第26-27页 |
| 2.2.1.4 目的基因与克隆载体的连接及转化 | 第27-28页 |
| 2.2.1.5 质粒的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.2 外切葡聚糖酶CBH1工程菌的获得 | 第29-35页 |
| 2.2.2.1 外切葡聚糖酶CBH1酵母表达载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.2.2 pPIC9K/cbh1的线性化 | 第30-31页 |
| 2.2.2.3 毕赤酵母GS115感受态的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.2.4 pPIC9K/cbh1电击转入毕赤酵母 | 第32页 |
| 2.2.2.5 pPIC9K/cbh1酵母转化子的筛选 | 第32-33页 |
| 2.2.2.6 pPIC9K/cbh1酵母转化子的验证 | 第33-35页 |
| 2.2.3 外切葡聚糖酶CBH1工程菌的诱导表达及纯化 | 第35-37页 |
| 2.2.3.1 CBH1工程菌的诱导表达 | 第35页 |
| 2.2.3.2 蛋白的沉淀与透析 | 第35-36页 |
| 2.2.3.3 蛋白的镍柱亲和层析 | 第36页 |
| 2.2.3.4 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第36-37页 |
| 2.3 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1的分子改造 | 第37-42页 |
| 2.3.1 外切葡聚糖酶CBH1环状结构的敲除 | 第37-38页 |
| 2.3.1.1 CBH1环状结构缺失突变基因的获得 | 第37-38页 |
| 2.3.1.2 CBH1环状结构缺失突变体工程菌的获得 | 第38页 |
| 2.3.1.3 CBH1环状结构缺失突变体的诱导表达及纯化 | 第38页 |
| 2.3.2 外切葡聚糖酶CBH1保守芳香族氨基酸的定点突变 | 第38-42页 |
| 2.3.2.1 CBH1保守芳香族氨基酸突变基因的获得 | 第40-41页 |
| 2.3.2.2 CBH1保守芳香族氨基酸突变体工程菌的获得 | 第41-42页 |
| 2.3.2.3 CBH1保守芳香族氨基酸突变体的诱导表达及纯化 | 第42页 |
| 2.4 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶eg2基因的真核表达 | 第42-43页 |
| 2.4.1 内切葡聚糖酶eg2基因的克隆 | 第42页 |
| 2.4.2 内切葡聚糖酶EG2工程菌的获得 | 第42-43页 |
| 2.4.3 内切葡聚糖酶EG2工程菌的诱导表达及纯化 | 第43页 |
| 2.5 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2的分子改造 | 第43-46页 |
| 2.5.1 内切葡聚糖酶EG2的定点突变 | 第43-45页 |
| 2.5.2 内切葡聚糖酶EG2突变基因的获得 | 第45-46页 |
| 2.5.3 内切葡聚糖酶EG2突变体工程菌的获得 | 第46页 |
| 2.5.4 内切葡聚糖酶EG2突变体的诱导表达及纯化 | 第46页 |
| 2.6 纯化蛋白性质的测定 | 第46-49页 |
| 2.6.1 纯化蛋白浓度测定 | 第46-47页 |
| 2.6.2 葡萄糖标准曲线的测定 | 第47页 |
| 2.6.3 纯化蛋白酶活力的测定 | 第47-48页 |
| 2.6.4 纯化蛋白最适温度的测定 | 第48页 |
| 2.6.5 纯化蛋白最适pH的测定 | 第48页 |
| 2.6.6 纯化蛋白热稳定性的测定 | 第48页 |
| 2.6.7 纯化蛋白动力学常数的测定 | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-71页 |
| 3.1 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶cbh1基因的真核表达 | 第49-54页 |
| 3.1.1 外切葡聚糖酶cbh1基因的克隆 | 第49页 |
| 3.1.2 外切葡聚糖酶cbh1基因的序列分析 | 第49-50页 |
| 3.1.3 外切葡聚糖酶CBH1酵母表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 3.1.4 外切葡聚糖酶CBH1酵母转化子的筛选 | 第51-53页 |
| 3.1.5 外切葡聚糖酶CBH1酵母转化子的PCR验证 | 第53页 |
| 3.1.6 外切葡聚糖酶CBH1工程菌的诱导表达及纯化 | 第53-54页 |
| 3.2 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1突变基因的真核表达 | 第54-57页 |
| 3.2.1 外切葡聚糖酶CBH1突变基因的获得 | 第54-55页 |
| 3.2.2 外切葡聚糖酶CBH1突变体工程菌的获得 | 第55-57页 |
| 3.2.3 外切葡聚糖酶CBH1突变体的诱导表达及分离纯化 | 第57页 |
| 3.3 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1及突变酶蛋白性质的测定结果分析 | 第57-61页 |
| 3.3.1 外切葡聚糖酶CBH1及突变酶的酶活测定结果分析 | 第57-58页 |
| 3.3.2 外切葡聚糖酶CBH1及突变酶最适温度的测定结果分析 | 第58-59页 |
| 3.3.3 外切葡聚糖酶CBH1及突变酶最适pH的测定结果分析 | 第59页 |
| 3.3.4 外切葡聚糖酶CBH1及突变酶热稳定性的测定结果分析 | 第59-60页 |
| 3.3.5 外切葡聚糖酶CBH1及突变酶动力学常数的测定结果分析 | 第60-61页 |
| 3.4 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶eg2基因的真核表达 | 第61-65页 |
| 3.4.1 内切葡聚糖酶eg2基因的克隆 | 第61-62页 |
| 3.4.2 内切葡聚糖酶eg2基因的序列分析 | 第62-63页 |
| 3.4.3 内切葡聚糖酶EG2酵母表达载体的构建 | 第63页 |
| 3.4.4 内切葡聚糖酶EG2酵母工程菌的获得 | 第63-64页 |
| 3.4.5 内切葡聚糖酶EG2工程菌的诱导表达及纯化 | 第64-65页 |
| 3.5 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2突变基因的真核表达 | 第65-67页 |
| 3.5.1 内切葡聚糖酶EG2突变基因的获得 | 第65-66页 |
| 3.5.2 内切葡聚糖酶EG2突变体工程菌的获得 | 第66页 |
| 3.5.3 内切葡聚糖酶EG2突变体的诱导表达及纯化 | 第66-67页 |
| 3.6 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2及其突变酶蛋白性质的测定结果分析 | 第67-71页 |
| 3.6.1 内切葡聚糖酶EG2及突变酶的酶活测定结果分析 | 第67页 |
| 3.6.2 内切葡聚糖酶EG2及突变酶最适温度的测定结果分析 | 第67-68页 |
| 3.6.3 内切葡聚糖酶EG2及突变酶最适pH的测定结果分析 | 第68-69页 |
| 3.6.4 内切葡聚糖酶EG2及突变酶热稳定性的测定结果分析 | 第69页 |
| 3.6.5 内切葡聚糖酶EG2及突变酶动力学常数的测定结果分析 | 第69-71页 |
| 4 讨论 | 第71-75页 |
| 4.1 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1及突变体酶学性质的研究 | 第71-73页 |
| 4.1.1 外切葡聚糖酶CBH1与缺失突变体CBH1-DM酶学性质的研究 | 第71-72页 |
| 4.1.2 外切葡聚糖酶CBH1与保守芳香族氨基酸突变体酶学性质的研究 | 第72-73页 |
| 4.2 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2及突变体酶学性质的研究 | 第73-75页 |
| 5 结论 | 第75-76页 |
| 5.1 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1的克隆、表达及纯化 | 第75页 |
| 5.2 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1的分子改造 | 第75页 |
| 5.3 嗜热毛壳菌内切葡聚糖苷酶EG2的克隆、表达及纯化 | 第75页 |
| 5.4 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2的分子改造 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
