| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 前言 | 第8-10页 |
| 材料与方法 | 第10-19页 |
| 1. 材料 | 第10-11页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第10页 |
| 1.2 酶、主要试剂及仪器 | 第10-11页 |
| 1.2.1 酶和主要购买试剂 | 第10页 |
| 1.2.2 自配试剂 | 第10-11页 |
| 1.2.3 仪器 | 第11页 |
| 2. 方法 | 第11-19页 |
| 2.1 pPIC9K-rhSPINK6表达载体的构建 | 第11-12页 |
| 2.2 转化子的筛选及种子库的建立 | 第12页 |
| 2.3 rhSPINK6蛋白的表达 | 第12页 |
| 2.4 rhSPINK6蛋白的初纯 | 第12-13页 |
| 2.5 Trypsin-Sepharose4B亲和填料的制备 | 第13页 |
| 2.6 rhSPINK6蛋白的精纯 | 第13页 |
| 2.7 rhSPINK6蛋白的鉴定 | 第13-14页 |
| 2.7.1 rhSPINK6蛋白的Tricine SDS-PAGE及Western blot鉴定 | 第13-14页 |
| 2.7.2 高效液相色谱(RP-HPLC)纯度分析 | 第14页 |
| 2.7.3 rhSPINK6的体外活性测定 | 第14页 |
| 2.8 常用分子生物学方法 | 第14-19页 |
| 2.8.1 3S柱离心式质粒小量快速抽提法 | 第14-15页 |
| 2.8.2 质粒碱法抽提(小抽) | 第15-16页 |
| 2.8.3 电泳、胶回收 | 第16页 |
| 2.8.4 感受态细胞GS115的制备以及电转化 | 第16-17页 |
| 2.8.5 Trince SDS-PAGE | 第17-18页 |
| 2.8.6 二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)测定蛋白含量 | 第18-19页 |
| 结果 | 第19-35页 |
| 1. 不同克隆中rhSPINK6的表达测定与种子库建立 | 第19页 |
| 2. rhSPINK6表达条件的优化 | 第19-20页 |
| 3. rhSPINK6的纯化工艺研究 | 第20-22页 |
| 3.1. 发酵液的处理 | 第20页 |
| 3.2. 初纯方式的选择 | 第20-22页 |
| 3.2.1. 纯化填料的选择 | 第20页 |
| 3.2.2. 静态吸附法选择最合适的缓冲体系 | 第20-21页 |
| 3.2.3. 离子交换法纯化rhSPINK6 | 第21-22页 |
| 4. rhSPINK6蛋白的精纯 | 第22-24页 |
| 4.1. 亲和填料的制备与偶联效率测定 | 第22页 |
| 4.2. 亲和层析纯化rhSPINK6 | 第22-24页 |
| 4.2.1. 亲和层析的条件优化 | 第22页 |
| 4.2.2. 亲和层析纯化rhSPINK6 | 第22-23页 |
| 4.2.3 rhSPINK6蛋白的保存 | 第23-24页 |
| 5. 高效液相色谱(RP-HPLC)纯度分析 | 第24页 |
| 6. rhSPINK6的纯化工艺与得率计算 | 第24-25页 |
| 7. rhSPINK6的蛋白印迹 | 第25页 |
| 8. rhSPINK6蛋白的结构确证 | 第25-26页 |
| 9. rhSPINK6的生物活性测定 | 第26-27页 |
| 10. rhSPINK6中试化发酵工艺初探 | 第27-35页 |
| 10.1. 种子培养 | 第27页 |
| 10.1.1. 一级生产种子 | 第27页 |
| 10.1.2. 二级生产种子 | 第27页 |
| 10.2. 发酵培养工艺研究 | 第27-29页 |
| 10.2.1. 不同因素对发酵影响的分析 | 第27-28页 |
| 10.2.3. 采用确定的发酵工艺发酵3批产品的总结资料 | 第28-29页 |
| 10.3. 发酵液胞液分离工艺研究 | 第29-30页 |
| 10.3.1. 发酵液胞液分离采用不同工艺的验证数据比较 | 第29页 |
| 10.3.2. 确定的离心工艺条件 | 第29页 |
| 10.3.3. 采用确定的离心条件离心3批发酵液的总结资料 | 第29-30页 |
| 10.4. 纯化工艺研究 | 第30-35页 |
| 10.4.1. 初步纯化工艺研究 | 第30-31页 |
| 10.4.2. 精度纯化工艺研究 | 第31-33页 |
| 10.4.3. 纯化工艺流程 | 第33-34页 |
| 10.4.4. 纯化工艺的优化 | 第34-35页 |
| 讨论 | 第35-37页 |
| 参考文献 | 第37-40页 |
| 综述：蛋白酶抑制剂在抗肿瘤方面的应用 | 第40-46页 |
| 参考文献 | 第43-46页 |
| 论文发表情况 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-48页 |
