| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 英文缩略语 | 第11-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-38页 |
| 1.1 微生物源蛋白酶的分类与来源 | 第18-21页 |
| 1.1.1 天冬氨酸蛋白酶 | 第19页 |
| 1.1.2 半胱氨酸蛋白酶 | 第19-20页 |
| 1.1.3 丝氨酸蛋白酶 | 第20页 |
| 1.1.4 金属蛋白酶 | 第20-21页 |
| 1.2 微生物蛋白酶的生产 | 第21-23页 |
| 1.2.1 产蛋白酶菌株的分离 | 第21页 |
| 1.2.2 产蛋白酶菌株的培养 | 第21-22页 |
| 1.2.3 产蛋白酶菌株的发酵 | 第22-23页 |
| 1.2.3.1 液体发酵 | 第22页 |
| 1.2.3.2 固体发酵 | 第22-23页 |
| 1.3 微生物蛋白酶的分离纯化 | 第23-24页 |
| 1.4 提高蛋白酶产量的传统方法 | 第24-26页 |
| 1.4.1 自然选育 | 第24-25页 |
| 1.4.2 诱变育种 | 第25页 |
| 1.4.3 体内基因重组育种 | 第25-26页 |
| 1.5 微生物蛋白酶的基因工程 | 第26-29页 |
| 1.6 微生物蛋白酶的蛋白酶工程 | 第29-33页 |
| 1.6.1 微生物蛋白酶工程的理性设计 | 第30-31页 |
| 1.6.2 微生物蛋白酶工程的定向进化 | 第31-32页 |
| 1.6.3 高通量筛选的定向进化 | 第32-33页 |
| 1.7 蛋白酶对大豆蛋白水解的开发应用 | 第33-35页 |
| 1.8 本课题的研究意义和主要研究内容 | 第35-38页 |
| 1.8.1 本课题的研究意义 | 第35-36页 |
| 1.8.2 本课题的主要研究内容 | 第36-38页 |
| 第二章 几种霉菌蛋白酶基因的克隆及序列分析 | 第38-87页 |
| 2.1 材料与方法 | 第38-52页 |
| 2.1.1 材料 | 第38-43页 |
| 2.1.1.1 试验菌株与载体 | 第38-39页 |
| 2.1.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 2.1.1.3 克隆霉菌蛋白酶基因的引物 | 第39-42页 |
| 2.1.1.4 培养基 | 第42页 |
| 2.1.1.5 主要仪器 | 第42-43页 |
| 2.1.2 方法 | 第43-52页 |
| 2.1.2.1 霉菌菌株的活化和培养 | 第43页 |
| 2.1.2.2 霉菌菌丝体 RNA 的提取和检测 | 第43-44页 |
| 2.1.2.3 反转录 cDNA 第一链的合成 | 第44页 |
| 2.1.2.4 未报道的丝氨酸蛋白酶基因的克隆 | 第44-48页 |
| 2.1.2.5 未报道的氨肽酶基因的克隆 | 第48-50页 |
| 2.1.2.6 已报道的蛋白酶基因的克隆 | 第50页 |
| 2.1.2.7 对蛋白酶基因的核苷酸序列的分析 | 第50页 |
| 2.1.2.8 密码子使用的偏好性 | 第50页 |
| 2.1.2.9 蛋白酶序列的基本性质分析 | 第50-51页 |
| 2.1.2.10 蛋白酶 Motif、功能位点和结构功能域的预测 | 第51页 |
| 2.1.2.11 蛋白酶氨基酸序列分子进化分析 | 第51页 |
| 2.1.2.12 蛋白酶的同源建模、二级结构和三级结构分析 | 第51页 |
| 2.1.2.13 氢键数和盐键数的预测 | 第51-52页 |
| 2.1.2.14 蛋白酶的溶剂可及表面积的预测 | 第52页 |
| 2.2 结果与分析 | 第52-85页 |
| 2.2.1 霉菌蛋白酶基因的克隆结果 | 第52-57页 |
| 2.2.1.1 霉菌菌丝体 RNA 的提取结果 | 第52页 |
| 2.2.1.2 未报道的丝氨酸蛋白酶基因和氨肽酶基因的克隆结果 | 第52-56页 |
| 2.2.1.3 已报道的蛋白酶基因的克隆结果 | 第56-57页 |
| 2.2.2 霉菌蛋白酶基因的序列分析 | 第57-85页 |
| 2.2.2.1 丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析 | 第57-68页 |
| 2.2.2.2 酸性蛋白酶的生物信息学分析 | 第68-78页 |
| 2.2.2.3 中性蛋白酶的生物信息学分析 | 第78-82页 |
| 2.2.2.4 氨肽酶的生物信息学分析 | 第82-85页 |
| 2.3 小结 | 第85-87页 |
| 2.3.1 几种霉菌蛋白酶基因的克隆结果 | 第85页 |
| 2.3.2 对克隆获得的蛋白酶基因的序列分析结果 | 第85-87页 |
| 第三章 蛋白酶基因的异源表达及酶学性质的研究 | 第87-123页 |
| 3.1 材料与方法 | 第87-100页 |
| 3.1.1 材料 | 第87-91页 |
| 3.1.1.1 菌株与质粒 | 第87-88页 |
| 3.1.1.2 酶与主要试剂 | 第88页 |
| 3.1.1.3 克隆霉菌蛋白酶基因的表达引物 | 第88-90页 |
| 3.1.1.4 主要仪器 | 第90页 |
| 3.1.1.5 培养基及储液 | 第90-91页 |
| 3.1.2 方法 | 第91-100页 |
| 3.1.2.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第91-93页 |
| 3.1.2.2 蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第93-96页 |
| 3.1.2.3 重组蛋白酶的酶活测定 | 第96-97页 |
| 3.1.2.4 重组蛋白酶的 SDS-PAGE 电泳鉴定 | 第97页 |
| 3.1.2.5 重组蛋白酶的 InVision~(TM)His-tag In-gel Stain 染色鉴定 | 第97页 |
| 3.1.2.6 重组毕赤酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第97页 |
| 3.1.2.7 重组蛋白酶的纯化 | 第97-98页 |
| 3.1.2.8 重组蛋白酶的酶谱试验 | 第98页 |
| 3.1.2.9 重组蛋白酶的酶学性质研究 | 第98-100页 |
| 3.2 结果与分析 | 第100-119页 |
| 3.2.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达结果 | 第100-101页 |
| 3.2.1.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中表达的表达载体构建结果 | 第100页 |
| 3.2.1.2 蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达结果 | 第100-101页 |
| 3.2.1.3 从包涵体中纯化溶解重组蛋白酶的结果 | 第101页 |
| 3.2.2 蛋白酶基因在毕赤酵母的诱导表达结果 | 第101-119页 |
| 3.2.2.1 蛋白酶基因在毕赤酵母中表达的表达载体构建 | 第101-102页 |
| 3.2.2.2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 | 第102-103页 |
| 3.2.2.3 重组毕赤酵母菌株诱导表达重组蛋白酶的结果 | 第103-106页 |
| 3.2.2.4 重组毕赤酵母菌株诱导表达发酵液酶活的结果 | 第106-107页 |
| 3.2.2.5 重组毕赤酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第107页 |
| 3.2.2.6 重组米曲霉 AlpII 的纯化及酶学性质结果 | 第107-112页 |
| 3.2.2.7 重组黑曲霉 AlpI 的纯化及酶学性质结果 | 第112-115页 |
| 3.2.2.8 重组米曲霉 NpI 的纯化及酶学性质结果 | 第115-119页 |
| 3.3 讨论 | 第119-120页 |
| 3.3.1 表达系统的选择 | 第119页 |
| 3.3.2 重组蛋白酶的表达量 | 第119-120页 |
| 3.3.3 重组蛋白酶的纯化 | 第120页 |
| 3.4 本章小结 | 第120-123页 |
| 第四章 重组蛋白酶分子的定点突变 | 第123-140页 |
| 4.1 材料与方法 | 第123-128页 |
| 4.1.1 材料 | 第123-126页 |
| 4.1.1.1 菌株与质粒 | 第123页 |
| 4.1.1.2 酶与主要试剂 | 第123-124页 |
| 4.1.1.3 定点突变引物 | 第124-126页 |
| 4.1.1.4 主要仪器 | 第126页 |
| 4.1.1.5 培养基及储液 | 第126页 |
| 4.1.2 方法 | 第126-128页 |
| 4.1.2.1 重组蛋白酶突变位点的确定 | 第126-127页 |
| 4.1.2.2 定点突变的方法 | 第127-128页 |
| 4.1.2.3 含突变位点的蛋白基因在毕赤酵母中的表达 | 第128页 |
| 4.1.2.4 含突变位点的重组蛋白酶的纯化和性质研究 | 第128页 |
| 4.1.2.5 突变后重组蛋白酶的结构预测分析 | 第128页 |
| 4.2 结果与分析 | 第128-139页 |
| 4.2.1 重组米曲霉 AlpII 的定点突变结果 | 第128-134页 |
| 4.2.1.1 米曲霉 AlpII 二硫键突变位点的确定 | 第128-129页 |
| 4.2.1.2 米曲霉 AlpII 二硫键突变位点的测序结果 | 第129-130页 |
| 4.2.1.3 突变的米曲霉 AlpII 在毕赤酵母中的表达及纯化结果 | 第130-131页 |
| 4.2.1.4 突变的重组米曲霉 AlpII 的酶学性质 | 第131-132页 |
| 4.2.1.5 突变重组米曲霉 AlpII 的结构分析结果 | 第132-134页 |
| 4.2.2 重组黑曲霉 AlpI 的定点突变结果 | 第134-137页 |
| 4.2.2.1 黑曲霉 AlpI 二硫键突变位点的确定 | 第134-135页 |
| 4.2.2.2 黑曲霉 AlpI 二硫键突变位点的测序鉴定结果 | 第135页 |
| 4.2.2.3 突变的黑曲霉 AlpI 在毕赤酵母中的表达结果 | 第135-136页 |
| 4.2.2.4 突变的重组黑曲霉 AlpI 的结构分析 | 第136-137页 |
| 4.2.3 重组米曲霉 NpI 的定点突变结果 | 第137-139页 |
| 4.2.3.1 米曲霉 NpI 基因的定点突变位点的确定 | 第137页 |
| 4.2.3.2 米曲霉 NpI 基因的定点突变的测序结果 | 第137-138页 |
| 4.2.3.3 突变的米曲霉 NpI 在毕赤酵母中的表达结果 | 第138-139页 |
| 4.3 小结 | 第139-140页 |
| 第五章 3 种重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解作用 | 第140-149页 |
| 5.1 材料与方法 | 第140-142页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第140页 |
| 5.1.2 大豆分离蛋白水解度的测定-甲醛滴定法 | 第140-141页 |
| 5.1.3 重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解 | 第141-142页 |
| 5.1.3.1 对大豆分离蛋白的水解试验过程 | 第141页 |
| 5.1.3.2 温度对大豆分离蛋白水解度的影响 | 第141页 |
| 5.1.3.3 pH 对大豆分离蛋白水解度的影响 | 第141页 |
| 5.1.3.4 水解时间对大豆分离蛋白水解度的影响 | 第141页 |
| 5.1.3.5 加酶量对大豆分离蛋白水解度的影响 | 第141-142页 |
| 5.3 结果与分析 | 第142-148页 |
| 5.3.1 重组米曲霉碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果 | 第142-144页 |
| 5.3.1.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第142页 |
| 5.3.1.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第142-143页 |
| 5.3.1.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第143页 |
| 5.3.1.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第143-144页 |
| 5.3.2 重组黑曲霉碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果 | 第144-146页 |
| 5.3.2.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第144-145页 |
| 5.3.2.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第145页 |
| 5.3.2.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第145页 |
| 5.3.2.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第145-146页 |
| 5.3.3 重组米曲霉中性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果 | 第146-148页 |
| 5.3.3.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第146-147页 |
| 5.3.3.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第147页 |
| 5.3.3.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第147页 |
| 5.3.3.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 | 第147-148页 |
| 5.4 小结 | 第148-149页 |
| 结论与展望 | 第149-153页 |
| 参考文献 | 第153-167页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第167-168页 |
| 致谢 | 第168-169页 |
| 附件 | 第169页 |
