| 缩略词表 | 第7-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 前言 | 第16-23页 |
| 第一部分：miR23a～27a～24在胚胎干细胞分化中的功能研究 | 第23-75页 |
| 前言 | 第23-28页 |
| 实验材料 | 第28-42页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第28页 |
| 1.1 菌株 | 第28页 |
| 1.2 质粒 | 第28页 |
| 2. 细胞株 | 第28页 |
| 2.1 小鼠胚胎干细胞(mESC) | 第28页 |
| 2.2 饲养层细胞 | 第28页 |
| 3. 实验动物 | 第28-29页 |
| 4. 主要试剂盒 | 第29页 |
| 5. 主要工具酶 | 第29页 |
| 6. 常用试剂 | 第29-32页 |
| 6.1 细胞培养用试剂 | 第29-30页 |
| 6.2 其它试剂 | 第30-32页 |
| 7. 主要引物 | 第32-35页 |
| 7.1 普通PCR引物 | 第32-33页 |
| 7.2 RT-qPCR引物 | 第33-35页 |
| 8. 常用生物学软件和数据库 | 第35页 |
| 9. 常用耗材 | 第35-36页 |
| 10. 常用仪器设备 | 第36-38页 |
| 11. 常用试剂的配制 | 第38-42页 |
| 11.1 细胞培养基的配制 | 第38-40页 |
| 11.2 分子实验试剂的配制 | 第40-42页 |
| 实验方法 | 第42-58页 |
| 1. 载体的制备 | 第42-46页 |
| 1.1 CRISPR切割载体的设计和构建 | 第42-43页 |
| 1.2 质粒的制备 | 第43-46页 |
| 2. 细胞培养 | 第46-51页 |
| 2.1 饲养层细胞的制备 | 第46-47页 |
| 2.2 mESC的培养 | 第47-48页 |
| 2.3 质粒DNA电穿孔法转染mESC | 第48-49页 |
| 2.4 mESC单克隆的接种与挑取 | 第49页 |
| 2.5 mESC基因组DNA的提取与质量检测 | 第49-50页 |
| 2.6 ESC囊胚注射 | 第50-51页 |
| 3. 干细胞特征的检测 | 第51-53页 |
| 3.1 碱性磷酸酶染色(AP染色) | 第51页 |
| 3.2 免疫荧光染色 | 第51-52页 |
| 3.3 实时荧光定量PCR | 第52-53页 |
| 4. ESC的体外分化实验 | 第53-54页 |
| 4.1 拟胚体(EB)形成 | 第53-54页 |
| 4.2 ESC向心肌细胞方向分化 | 第54页 |
| 5. 畸胎瘤形成实验 | 第54-58页 |
| 5.1 将ESC接种到重度联合免疫缺陷(SCID)鼠皮下 | 第54-55页 |
| 5.2 畸胎瘤的取材与固定 | 第55页 |
| 5.3 畸胎瘤标本的脱水、包埋与切片 | 第55页 |
| 5.4 HE染色 | 第55-56页 |
| 5.5 免疫组织化学染色 | 第56-58页 |
| 实验结果 | 第58-70页 |
| 1. 构建miR-23~27~24双基因簇敲除mESC | 第58-63页 |
| 1.1 sgRNA的设计及载体构建 | 第58-59页 |
| 1.2 利用CRISPR/Cas9系统获得miR-23～27～24双基因簇敲除mESC | 第59-60页 |
| 1.3 潜在脱靶位点检测 | 第60-62页 |
| 1.4 miR-23～27～24双基因簇敲除mESC基本特征的鉴定 | 第62-63页 |
| 2. miR-23~27~24基因簇在mESC分化中的功能研究 | 第63-68页 |
| 2.1 拟胚体实验验证miR-23～27～24基因簇双敲除mESC分化缺陷 | 第63-64页 |
| 2.2 心肌分化实验验证miR-23～27～24基因簇双敲除mESC分化缺陷 | 第64-66页 |
| 2.3 miR-23～27～24双基因簇敲除mESC成瘤能力降低 | 第66-68页 |
| 3. 构建miR-23~27~24双基因簇敲除小鼠 | 第68-70页 |
| 3.1 嵌合体小鼠的建立 | 第68-69页 |
| 3.2 嵌合体小鼠的交配策略 | 第69页 |
| 3.3 嵌合体小鼠没有进入种系传递 | 第69-70页 |
| 讨论 | 第70-74页 |
| 总结 | 第74-75页 |
| 第二部分：单倍体胚胎干细胞突变体文库的建立和应用 | 第75-127页 |
| 前言 | 第75-79页 |
| 实验材料 | 第79-86页 |
| 1. 质粒和载体 | 第79-80页 |
| 2. 细胞株 | 第80页 |
| 3. 主要试剂 | 第80-81页 |
| 3.1 细胞培养用试剂 | 第80页 |
| 3.2 其它试剂 | 第80-81页 |
| 4. 主要引物 | 第81-82页 |
| 4.1 Splinkerette PCR引物 | 第81页 |
| 4.2 高通量测序引物 | 第81-82页 |
| 4.3 RT-qPCR引物 | 第82页 |
| 5. 常用耗材 | 第82-83页 |
| 6. 常用仪器设备 | 第83页 |
| 7. 常用试剂盒 | 第83-84页 |
| 8. 主要试剂的配制 | 第84-86页 |
| 8.1 细胞培养基的配制 | 第84-85页 |
| 8.2 其它溶液的配制 | 第85-86页 |
| 实验方法 | 第86-102页 |
| 1. 细胞实验 | 第86-87页 |
| 1.1 饲养层细胞的制备 | 第86页 |
| 1.2 单倍体胚胎干细胞(haESC)的培养 | 第86页 |
| 1.3 流式细胞术测定单倍体比例 | 第86-87页 |
| 1.4 碱性磷酸酶染色(AP)染色 | 第87页 |
| 1.5 撤掉培养体系中的LIF,诱导ESC分化 | 第87页 |
| 1.6 拟胚体(EB)形成 | 第87页 |
| 2. DNA和RNA实验 | 第87-95页 |
| 2.1 mESC基因组DNA的提取与质量检测 | 第87页 |
| 2.2 Splinkerette PCR | 第87-90页 |
| 2.3 分析转座子在mESC基因组中的插入位点 | 第90页 |
| 2.4 三引物竞争性PCR确定转座子在mESC基因组中的插入位点 | 第90-91页 |
| 2.5 Southern Blot鉴定转座子插入拷贝数 | 第91-94页 |
| 2.6 RT-PCR | 第94-95页 |
| 3. haESC染色体中期分裂相的制备 | 第95页 |
| 4. Splinkerette PCR结合高通量DNA 二代测序 | 第95-102页 |
| 4.1 原理及示意图 | 第95-96页 |
| 4.2 构建二代测序文库 | 第96-101页 |
| 4.3 测序数据的生物信息学分析 | 第101-102页 |
| 实验结果 | 第102-121页 |
| 1. 单倍体ESC的培养、鉴定及分选 | 第102-103页 |
| 1.1 haESC基本特性的鉴定 | 第102页 |
| 1.2 单倍体ESC的分选 | 第102-103页 |
| 2. 构建haESC全基因突变体混合文库 | 第103-108页 |
| 2.1 piggyBac转座子介导的基因捕获载体 | 第103-104页 |
| 2.2 在单倍体胚胎干细胞中构建突变体文库的策略 | 第104-105页 |
| 2.3 利用转座子载体在EG1中建立突变体文库 | 第105-107页 |
| 2.4 利用转座子载体在OG3中建立突变体文库 | 第107-108页 |
| 3. 混合突变体文库的鉴定 | 第108-112页 |
| 3.1 突变文库中纯合突变比例 | 第108-109页 |
| 3.2 PB转座子插入拷贝数的分析 | 第109-110页 |
| 3.3 构建突变体文库基因组整合位点高通量测序文库 | 第110-111页 |
| 3.4 突变体文库基因组覆盖率的分析 | 第111-112页 |
| 4. 构建小规模的矩阵式突变体文库并进行了分化筛选 | 第112-116页 |
| 4.1 确定了ESC分化筛选的条件及评判标准 | 第113-114页 |
| 4.2 矩阵式突变体文库的建立及ESC退出多能性相关基因的筛选方案 | 第114页 |
| 4.3 构建了小规模的矩阵式突变体文库并进行了分化筛选 | 第114-116页 |
| 5. 候选基因的鉴定 | 第116-121页 |
| 5.1 候选克隆的插入拷贝数和纯合突变检测 | 第116页 |
| 5.2 转座子的插入发挥了基因捕获的功能 | 第116-119页 |
| 5.3 对部分阳性克隆进行了回复实验分析 | 第119-121页 |
| 讨论 | 第121-126页 |
| 总结 | 第126-127页 |
| 参考文献 | 第127-139页 |
| 文献综述 | 第139-147页 |
| 参考文献 | 第143-147页 |
| 致谢 | 第147-149页 |
| 个人简历 | 第149-151页 |
