| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第15-34页 |
| 第一章 LH调节基因表达的信号通路研究进展 | 第15-22页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 LH诱导的信号转导通路 | 第15-22页 |
| 1.2.1 cAMP/PKA和MAPK信号通路 | 第15-17页 |
| 1.2.2 PKC信号通路 | 第17-18页 |
| 1.2.3 PI3K/Akt信号通路 | 第18页 |
| 1.2.4 EGFR信号通路 | 第18-20页 |
| 1.2.5 LH通过信号通路诱导基因表达的研究进展 | 第20-22页 |
| 第二章 TIMP3基因研究进展 | 第22-34页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 基质金属蛋白酶（MMPS）和基质蛋白酶组织抑制因子（TIMPS） | 第22-24页 |
| 2.2.1 MMPs | 第22-23页 |
| 2.2.2 TIMPs | 第23-24页 |
| 2.3 TIMP3的结构 | 第24-25页 |
| 2.4 TIMP3基因的组织表达谱分析 | 第25页 |
| 2.5 TIMP3的表达调控 | 第25-30页 |
| 2.5.1 激素对TIMP3表达的调节 | 第25-27页 |
| 2.5.2 细胞或生长因子对TIMP3表达的调节 | 第27页 |
| 2.5.3 miRNA对TIMP3表达的调节 | 第27-30页 |
| 2.6 TIMP3的生物学功能 | 第30-32页 |
| 2.6.1 TIMP3对细胞凋亡的作用 | 第30-31页 |
| 2.6.2 TIMP3对血管生成的影响 | 第31页 |
| 2.6.3 TIMP3与组织重塑和疾病的关系 | 第31页 |
| 2.6.4 TIMP3对肿瘤的抑制作用 | 第31-32页 |
| 2.7 本研究的目的和意义 | 第32-34页 |
| 试验研究 | 第34-103页 |
| 第三章 奶山羊TIMP3基因的克隆及表达分析 | 第34-51页 |
| 3.1 引言 | 第34-35页 |
| 3.2 材料与方法 | 第35-42页 |
| 3.2.1 试验动物 | 第35页 |
| 3.2.2 主要仪器设备 | 第35页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第35页 |
| 3.2.4 卵泡及卵泡细胞的分离 | 第35-36页 |
| 3.2.5 RNA提取和反转录 | 第36-37页 |
| 3.2.6 TIMP3基因全长cDNA的克隆及生物信息学分析 | 第37-41页 |
| 3.2.7 Real-time PCR分析 | 第41页 |
| 3.2.8 免疫组织化学分析 | 第41-42页 |
| 3.2.9 统计学分析 | 第42页 |
| 3.3 结果与分析 | 第42-48页 |
| 3.3.1 提取的奶山羊总RNA检测 | 第42页 |
| 3.3.2 TIMP3 mRNA序列的克隆及生物信息学分析 | 第42-46页 |
| 3.3.3 TIMP3在山羊各组织中的表达分析 | 第46页 |
| 3.3.4 TIMP3在不同产羔数奶山羊卵巢中的表达分析 | 第46-47页 |
| 3.3.5 TIMP3在不同大小卵泡及卵泡细胞中的表达分析 | 第47-48页 |
| 3.4 讨论 | 第48-49页 |
| 3.5 小结 | 第49-51页 |
| 第四章 hCG对奶山羊卵巢颗粒细胞TIMP3表达调节的研究 | 第51-74页 |
| 4.1 引言 | 第51-52页 |
| 4.2 材料与方法 | 第52-62页 |
| 4.2.1 试验动物 | 第52页 |
| 4.2.2 仪器设备 | 第52页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第52页 |
| 4.2.4 奶山羊卵巢GCs的分离培养及鉴定 | 第52-54页 |
| 4.2.5 Western blot分析蛋白水平 | 第54页 |
| 4.2.6 奶山羊TIMP3启动子的克隆与生物信息学分析 | 第54-55页 |
| 4.2.7 奶山羊TIMP3启动子 5'缺失片段的克隆及载体构建 | 第55-56页 |
| 4.2.8 细胞转染及相对荧光素酶活性测定 | 第56-57页 |
| 4.2.9 TIMP3基因启动子转录因子结合位点突变分析。 | 第57-58页 |
| 4.2.10 核蛋白提取和电泳迁移率实验（EMSA） | 第58-60页 |
| 4.2.11 染色质免疫共沉淀（ChIP） | 第60-61页 |
| 4.2.12 pcDNA3.1 过表达载体构建及干扰siRNA的合成 | 第61-62页 |
| 4.2.13 统计学分析 | 第62页 |
| 4.3 结果与分析 | 第62-72页 |
| 4.3.1 奶山羊卵巢GCs的鉴定 | 第62-63页 |
| 4.3.2 hCG处理对奶山羊卵巢GCs中TIMP3表达的影响 | 第63-64页 |
| 4.3.3 hCG诱导的细胞信号通路对TIMP3表达的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.4 TIMP3启动子的克隆与分析 | 第65-66页 |
| 4.3.5 TIMP3启动子不同大小片段的克隆及载体构建 | 第66-67页 |
| 4.3.6 TIMP3启动子活性分析 | 第67-68页 |
| 4.3.7 TIMP3启动子活性区转录因子结合位点突变分析 | 第68-69页 |
| 4.3.8 EMSA和ChIP鉴定转录因子结合 | 第69页 |
| 4.3.9 Sp1过表达载体构建 | 第69-70页 |
| 4.3.10 过表达和干扰效率验证 | 第70-71页 |
| 4.3.11 Sp1过表达和干扰对TIMP3的调节作用。 | 第71-72页 |
| 4.4 讨论 | 第72-73页 |
| 4.5 小结 | 第73-74页 |
| 第五章 miR-221/222，miR-21和miR-181b对奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3表达调节的研究 | 第74-88页 |
| 5.1 引言 | 第74-75页 |
| 5.2 材料与方法 | 第75-79页 |
| 5.2.1 试验动物 | 第75页 |
| 5.2.2 仪器设备 | 第75页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第75页 |
| 5.2.4 奶山羊卵巢GCs的分离培养 | 第75页 |
| 5.2.5 奶山羊TIMP3基因 3'UTR区miRNA靶结合位点的预测 | 第75-76页 |
| 5.2.6 miRNA靶结合位点及位点突变双荧光素酶报告载体的构建 | 第76-77页 |
| 5.2.7 miRNA模拟物的化学合成 | 第77-78页 |
| 5.2.8 细胞转染和荧光素酶检测 | 第78页 |
| 5.2.9 Real-time PCR和Western Blot检测 | 第78页 |
| 5.2.10 细胞活力检测（MTT） | 第78-79页 |
| 5.2.11 统计学分析 | 第79页 |
| 5.3 结果与分析 | 第79-85页 |
| 5.3.1 TIMP3基因 3’UTR区mi RNA靶位点的预测 | 第79页 |
| 5.3.2 双荧光素酶报告载体的构建 | 第79-80页 |
| 5.3.3 靶位点突变双荧光素酶报告载体的构建 | 第80-82页 |
| 5.3.4 荧光素酶活性检测 | 第82-84页 |
| 5.3.5 Real-time PCR和Western Blot检测miRNA对TIMP3 m RNA和蛋白水平的影响 | 第84页 |
| 5.3.6 miR-21，miR-221，miR-222和miR-181b对奶山羊卵巢GCs活力的影响 | 第84-85页 |
| 5.4 讨论 | 第85-86页 |
| 5.5 小结 | 第86-88页 |
| 第六章 TIMP3在奶山羊卵巢颗粒细胞中潜在功能研究 | 第88-103页 |
| 6.1 引言 | 第88页 |
| 6.2 材料与方法 | 第88-95页 |
| 6.2.1 试验动物 | 第88-89页 |
| 6.2.2 仪器设备 | 第89页 |
| 6.2.3 主要试剂 | 第89页 |
| 6.2.4 奶山羊卵巢GCs的分离培养 | 第89页 |
| 6.2.5 RNA提取和反转录 | 第89页 |
| 6.2.6 腺病毒介导的TIMP3过表达载体的构建 | 第89-91页 |
| 6.2.7 重组腺病毒的包装及纯化 | 第91-92页 |
| 6.2.8 重组腺病毒的扩增和滴度测定 | 第92-93页 |
| 6.2.9 TIMP3 siRNA的设计和合成 | 第93页 |
| 6.2.10 Real-time PCR和western blot蛋白水平检测 | 第93页 |
| 6.2.11 细胞活力和细胞凋亡检测 | 第93-94页 |
| 6.2.12 ELSIA检测孕酮浓度 | 第94页 |
| 6.2.13 统计学分析 | 第94-95页 |
| 6.3 结果与分析 | 第95-100页 |
| 6.3.1 重组腺病毒Ad-TIMP3的构建、包装及滴度测定 | 第95页 |
| 6.3.2 重组腺病毒介导的过表达效率验证 | 第95-96页 |
| 6.3.3 合成的TIMP3特异性siRNA干扰效率验证 | 第96页 |
| 6.3.4 重组腺病毒介导的TIMP3过表达对GCs活性及凋亡的影响 | 第96-98页 |
| 6.3.5 TIMP3下调对hCG诱导的孕酮合成及类固醇激素酶表达的影响 | 第98-99页 |
| 6.3.6 hCG处理对奶山羊卵巢GCs中ADAM7，DCN和FN表达的影响 | 第99页 |
| 6.3.7 TIMP3下调对奶山羊卵巢GCs中ADAM7，DCN和FN表达的影响 | 第99-100页 |
| 6.4 讨论 | 第100-102页 |
| 6.5 小结 | 第102-103页 |
| 结论 | 第103-104页 |
| 创新点 | 第104-105页 |
| 进一步研究的问题 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-120页 |
| 缩略词 | 第120-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 作者简介 | 第123页 |
