| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 1 引言 | 第9-18页 |
| ·流感概述 | 第9-11页 |
| ·流感病毒的基因组重要结构 | 第11-14页 |
| ·HA 基因 | 第12-13页 |
| ·NA 基因 | 第13页 |
| ·NP 基因 | 第13页 |
| ·NS 基因 | 第13-14页 |
| ·M 基因 | 第14页 |
| ·PB1、PB2、PA 基因 | 第14页 |
| ·细胞系的概述 | 第14-16页 |
| ·细胞系的特点 | 第14-15页 |
| ·建立细胞系的要求 | 第15-16页 |
| ·流感病毒的细胞培养研究进展 | 第16-17页 |
| ·逆转录病毒载体系统的特点 | 第17-18页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第18页 |
| 2 实验一 稳定表达流感病毒 PR8 HA 蛋白的 MDCK 细胞系的建立和鉴定 | 第18-30页 |
| ·材料 | 第18-21页 |
| ·质粒、菌种和毒株 | 第18-19页 |
| ·主要商品试剂 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19页 |
| ·主要溶液和培养基的配制 | 第19-21页 |
| ·引物合成 | 第21页 |
| ·方法 | 第21-26页 |
| ·大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制作 | 第21-22页 |
| ·流感病毒 PR8HA 基因的扩增 | 第22页 |
| ·质粒的转化 | 第22页 |
| ·载体质粒的制备 | 第22页 |
| ·pMX 载体、基因PR8HA 的双酶切 | 第22-23页 |
| ·DNA 片段的纯化回收 | 第23页 |
| ·重组pMX-PR8HA 载体的连接构建 | 第23-24页 |
| ·重组载体pMX-PR8HA 的 PCR 鉴定 | 第24页 |
| ·重组载体pMX-PR8HA 的酶切鉴定 | 第24页 |
| ·重组载体pMX-PR8HA 的序列测定 | 第24页 |
| ·重组载体及辅助质粒的制备 | 第24-25页 |
| ·转染293T 细胞拯救病毒粒子 | 第25页 |
| ·感染 MDCK 细胞 | 第25页 |
| ·阳性细胞的扩大培养 | 第25页 |
| ·PR8HA 基因多抗的制备 | 第25页 |
| ·PR8HA 细胞系DNA 的PCR 鉴定 | 第25-26页 |
| ·PR8HA 细胞系RNA 的RT-PCR 鉴定 | 第26页 |
| ·PR8HA 细胞间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第26页 |
| ·细胞系 PR8HA 基因表达产物的western blot 鉴定 | 第26页 |
| ·结果 | 第26-29页 |
| ·PR8HA 基因的克隆 | 第26-27页 |
| ·pMX-PR8HA 重组载体的鉴定 | 第27-28页 |
| ·重组载体pMX-PR8HA 的序列测定 | 第28页 |
| ·PR8HA 细胞系DNA 的PCR 鉴定和RNA 的RT-PCR 鉴定 | 第28页 |
| ·PR8HA 细胞系间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第28-29页 |
| ·PR8HA 细胞系表达产物的 Western blot 检测 | 第29页 |
| ·讨论 | 第29-30页 |
| 3 实验二 稳定表达禽流感病毒GDHA、NA 蛋白的MDCK 细胞系的建立和鉴定 | 第30-42页 |
| ·材料 | 第30-31页 |
| ·质粒、菌种和毒株 | 第30页 |
| ·主要商品试剂 | 第30-31页 |
| ·主要仪器 | 第31页 |
| ·主要溶液和培养基的配制 | 第31页 |
| ·引物合成 | 第31页 |
| ·方法 | 第31-35页 |
| ·禽流感病毒 GDHA、GDNA 基因的扩增 | 第31-32页 |
| ·pMX 载体、基因GDHA、基因 GDNA 的双酶切 | 第32页 |
| ·重组pMX-GDHA、pMX-GDNA 载体的连接构建 | 第32页 |
| ·重组载体pMX-GDHA、pMX-GDNA 的 PCR 鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组载体pMX-GDHA、pMX-GDNA 的酶切鉴定 | 第33页 |
| ·重组载体pMX-GDHA、pMX-GDNA 的序列测定 | 第33页 |
| ·重组载体及辅助质粒的制备 | 第33页 |
| ·转染293T 细胞拯救病毒粒子 | 第33页 |
| ·MDCK 细胞的感染 | 第33页 |
| ·阳性细胞的扩大培养 | 第33页 |
| ·GDHA、NA 基因多抗的制备 | 第33-34页 |
| ·GDHA、NA 细胞系DNA 的PCR 鉴定 | 第34页 |
| ·GDHA、NA 细胞系RNA 的RT-PCR 鉴定 | 第34页 |
| ·GDNA、GDHA 细胞系间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第34页 |
| ·细胞系 GDHA、NA 基因表达产物的western blot 鉴定 | 第34页 |
| ·缺陷性流感病毒的拯救 | 第34页 |
| ·MDCK 细胞的感染 | 第34-35页 |
| ·结果 | 第35-41页 |
| ·GDHA、GDNA 基因的扩增 | 第35页 |
| ·pMX-GDHA、pMX-GDNA 重组载体的鉴定 | 第35-37页 |
| ·重组载体pMX-GDHA、pMX-GDNA 的序列测定 | 第37页 |
| ·GDHA、GDNA 细胞系DNA 的PCR 鉴定和RNA 的RT-PCR 鉴定 | 第37-39页 |
| ·GDHA、GDNA 细胞系间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第39页 |
| ·GDHA、GDNA 细胞系表达产物的Western blot 检测 | 第39-40页 |
| ·缺失 NA 基因的流感病毒的鉴定 | 第40-41页 |
| ·讨论 | 第41-42页 |
| 4 实验三 稳定表达禽流感病毒 H9N2 NA 的 MDCK 细胞系的建立和鉴定 | 第42-49页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·质粒、菌种和毒株 | 第42页 |
| ·主要商品试剂 | 第42-43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·主要溶液和培养基的配制 | 第43页 |
| ·引物合成 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-45页 |
| ·H9N2 病毒的增殖 | 第43页 |
| ·提取流感病毒 H9N2 的 RNA | 第43页 |
| ·流感病毒 H9N2 NA 基因的扩增 | 第43-44页 |
| ·pMX 载体、基因H9N2-NA 的双酶切 | 第44页 |
| ·重组pMX-H9N2NA 载体的连接构建 | 第44页 |
| ·重组载体pMX-H9N2 NA PCR 的鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组载体pMX-H9N2 NA 的酶切鉴定 | 第45页 |
| ·重组载体pMX-H9N2NA 的序列测定 | 第45页 |
| ·表达 H9N2 NA 细胞系细胞的克隆培养 | 第45页 |
| ·H9N2 NA 细胞系DNA 的PCR 鉴定和RNA 的RT-PCR 鉴定 | 第45页 |
| ·H9N2 NA 细胞系间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第45页 |
| ·结果 | 第45-49页 |
| ·表达 H9N2 NA 细胞系的形态 | 第45-46页 |
| ·H9N2 NA 基因的扩增 | 第46页 |
| ·pMX-H9N2 NA 重组载体的鉴定 | 第46-47页 |
| ·重组载体pMX-H9N2NA 的序列测定 | 第47页 |
| ·H9N2NA 细胞系DNA 的PCR 鉴定和RNA 的RT-PCR 鉴定 | 第47-48页 |
| ·H9N2NA 细胞系间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49页 |
| 5 结论 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-57页 |
| 附录 | 第57-58页 |
| 作者简介 | 第58页 |
