| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第12-30页 |
| 1.1 绿色荧光蛋白（GFP）概述 | 第12-18页 |
| 1.1.1 绿色荧光蛋白的发现与发展历程 | 第12页 |
| 1.1.2 绿色荧光蛋白的结构和发光机理 | 第12-13页 |
| 1.1.3 绿色荧光蛋白的突变及分类 | 第13-15页 |
| 1.1.4 绿色荧光蛋白的性质和应用 | 第15-18页 |
| 1.2 基于绿色荧光蛋白的双分子荧光互补技术 | 第18-22页 |
| 1.2.1 基于绿色荧光蛋白的双分子互补技术简介 | 第18页 |
| 1.2.2 基于绿色荧光蛋白的双分子荧光互补技术的发展 | 第18-19页 |
| 1.2.3 基于绿色荧光蛋白的双分子荧光互补技术的应用 | 第19-21页 |
| 1.2.4 基于绿色荧光蛋白的双分子荧光互补技术的优缺点 | 第21-22页 |
| 1.3 蛋白质翻译后修饰 | 第22-26页 |
| 1.3.1 磷酸化修饰 | 第22页 |
| 1.3.2 检测蛋白激酶活性和对抑制剂进行筛选 | 第22-26页 |
| 1.4 蛋白磷酸酶的分类 | 第26-27页 |
| 1.5 蛋白磷酸酶活性检测手段 | 第27-28页 |
| 1.6 本文构思 | 第28-30页 |
| 第2章 绿色荧光蛋白大片段的获取 | 第30-41页 |
| 2.1 前言 | 第30-31页 |
| 2.2 实验部分 | 第31-35页 |
| 2.2.1 材料和仪器设备 | 第31-32页 |
| 2.2.2 感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.2.3 重组质粒pET28t GFP的构建 | 第32-34页 |
| 2.2.4 体外酶切完整蛋白获取大片段 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第35-40页 |
| 2.3.1 重组质粒pET28-t GFP的构建 | 第35-37页 |
| 2.3.2 tGFP大片段的表达纯化 | 第37-38页 |
| 2.3.3 体外酶切获取tGFP大片段与S-peptide的复合验证 | 第38-40页 |
| 2.4 本章小结 | 第40-41页 |
| 第3章 磷酸化调控的半合成荧光蛋白用于蛋白激酶活性的免标记检测 | 第41-55页 |
| 3.1 前言 | 第41-42页 |
| 3.2 实验部分 | 第42-44页 |
| 3.2.1 材料和仪器设备 | 第42-43页 |
| 3.2.2 大肠杆菌中表达并纯化完整绿色荧光蛋白以及绿色荧光蛋白大片段的获取 | 第43页 |
| 3.2.3 绿色荧光蛋白大片段与S-peptide的复合 | 第43页 |
| 3.2.4 羧肽酶（CPY）水解底物多肽S-peptide以及磷酸化多肽P-peptide | 第43页 |
| 3.2.5 特异性识别PKA活性及抑制剂的检测 | 第43-44页 |
| 3.2.6 MCF-7 细胞培养和裂解液的制备 | 第44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-53页 |
| 3.3.1 检测原理及验证 | 第44-45页 |
| 3.3.2 tGFP与S-peptide的复合条件优化 | 第45-48页 |
| 3.3.3 CPY消化多肽的条件优化 | 第48-49页 |
| 3.3.4 检测PKA活性 | 第49-50页 |
| 3.3.5 抑制剂活性检测 | 第50-52页 |
| 3.3.6 癌细胞裂解液中蛋白激酶活性的检测 | 第52-53页 |
| 3.4 本章小结 | 第53-55页 |
| 第4章 磷酸化调控的半合成荧光蛋白用于蛋白磷酸酶活性的免标记检测 | 第55-62页 |
| 4.1 前言 | 第55-56页 |
| 4.2 实验部分 | 第56-57页 |
| 4.2.1 实验仪器与试剂 | 第56页 |
| 4.2.2 大肠杆菌中表达并纯化完整绿色荧光蛋白以及绿色荧光蛋白大片段的获取 | 第56页 |
| 4.2.3 羧肽酶（CPY）水解底物多肽S-peptide以及磷酸化多肽P-peptide | 第56页 |
| 4.2.4 PP1酶活性检测可行性验证 | 第56-57页 |
| 4.2.5 PP1酶活性检测 | 第57页 |
| 4.2.6 PP1检测特异性考查 | 第57页 |
| 4.2.7 多肽序列对检测的影响 | 第57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-61页 |
| 4.3.1 检测原理 | 第57-58页 |
| 4.3.2 PP1酶活性检测可行性验证 | 第58页 |
| 4.3.3 CPY水解多肽的条件优化 | 第58-59页 |
| 4.3.4 蛋白磷酸酶PP1活性检测 | 第59页 |
| 4.3.5 多肽序列的影响 | 第59-61页 |
| 4.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-72页 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
