多模块组装构建组合文库的新技术研究
| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 引言 | 第11-13页 |
| 第一章 综述 | 第13-23页 |
| 1.1 现代生物技术 | 第13-14页 |
| 1.1.1 基因工程 | 第13页 |
| 1.1.2 蛋白质工程 | 第13-14页 |
| 1.2 蛋白质体外进化 | 第14-15页 |
| 1.3 组合文库构建方法 | 第15-20页 |
| 1.3.1 突变型文库 | 第15-17页 |
| 1.3.1.1 易错PCR | 第15-16页 |
| 1.3.1.2 单分子PCR | 第16页 |
| 1.3.1.3 易错滚环扩增技术 | 第16页 |
| 1.3.1.4 随机插入/删除链交换突变 | 第16页 |
| 1.3.1.5 密码子随机切除技术 | 第16页 |
| 1.3.1.6 多元基因组工程 | 第16-17页 |
| 1.3.2 组合型文库 | 第17-20页 |
| 1.3.2.1 DNA改组 | 第17页 |
| 1.3.2.2 交错延伸 | 第17-18页 |
| 1.3.2.3 随机引物体外重组 | 第18页 |
| 1.3.2.4 临时模板随机嵌合技术 | 第18页 |
| 1.3.2.5 串联重复插入 | 第18页 |
| 1.3.2.6 渐进式切割产生杂合酶技术 | 第18-19页 |
| 1.3.2.7 不依赖于同源性的蛋白质重组方法 | 第19页 |
| 1.3.2.8 易于操作的DNA重组技术 | 第19页 |
| 1.3.2.9 非同源随机重组技术 | 第19-20页 |
| 1.3.2.10 外显子重组 | 第20页 |
| 1.3.2.11 结构域改组 | 第20页 |
| 1.4 组合文库的筛选方法 | 第20-22页 |
| 1.4.1 平板筛选 | 第20-21页 |
| 1.4.2 噬菌体展示技术 | 第21页 |
| 1.4.3 核糖体展示技术 | 第21-22页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 组合文库的构建 | 第23-67页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验仪器、试剂 | 第23-25页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第24-25页 |
| 2.3 溶液的配置 | 第25-26页 |
| 2.4 组合文库构建实验原理 | 第26-27页 |
| 2.5 组合文库构建实验流程 | 第27-48页 |
| 2.5.1 蛋白质二级结构模块的选取 | 第27-31页 |
| 2.5.2 酶的选取 | 第31页 |
| 2.5.2.1 限制性核酸内切酶 | 第31页 |
| 2.5.2.2 DNA连接酶 | 第31页 |
| 2.5.2.3 DNA聚合酶 | 第31页 |
| 2.5.3 Linker及引物的设计 | 第31-34页 |
| 2.5.3.1 模块间Linker设计 | 第32-34页 |
| 2.5.3.2 构建重组质粒所需Linker设计 | 第34页 |
| 2.5.3.3 PCR扩增引物设计 | 第34页 |
| 2.5.3.4 形成双链的引物设计 | 第34页 |
| 2.5.4 DNA单链变双链 | 第34-35页 |
| 2.5.4.1 模块DNA双链（除首尾链）的形成 | 第34-35页 |
| 2.5.4.2 首尾链DNA双链的形成 | 第35页 |
| 2.5.5 双链DNA的酶切 | 第35-37页 |
| 2.5.5.1 模块DNA双链（除首尾链）的酶切 | 第35页 |
| 2.5.5.2 首尾链DNA双链的酶切 | 第35-36页 |
| 2.5.5.3 酶切效果的验证 | 第36-37页 |
| 2.5.6 模块间的连接重组 | 第37-41页 |
| 2.5.6.1 连接方式的设计 | 第37-38页 |
| 2.5.6.2 首尾链加入比例的设计 | 第38-39页 |
| 2.5.6.3 连接温度的选取 | 第39页 |
| 2.5.6.4 连接时间的确定 | 第39-40页 |
| 2.5.6.5 连接辅助因子探究 | 第40页 |
| 2.5.6.6 模块DNA浓度的设计 | 第40-41页 |
| 2.5.6.7 连接产物的验证 | 第41页 |
| 2.5.7 连接产物的扩增 | 第41-42页 |
| 2.5.8 重组DNA的初步检测 | 第42-44页 |
| 2.5.9 重组DNA的回收纯化 | 第44-45页 |
| 2.5.9.1 目的片段的回收 | 第44-45页 |
| 2.5.9.2 目的片段的纯化 | 第45页 |
| 2.5.10 质粒载体的提取 | 第45-46页 |
| 2.5.11 质粒载体及重组DNA的酶切纯化 | 第46-47页 |
| 2.5.12 重组DNA与质粒载体的连接 | 第47页 |
| 2.5.13 重组质粒的转化 | 第47-48页 |
| 2.5.14 阳性克隆的筛选及鉴定 | 第48页 |
| 2.6 结果与讨论 | 第48-64页 |
| 2.6.1 双链DNA的酶切 | 第48-49页 |
| 2.6.2 模块间的连接重组及其优化 | 第49-59页 |
| 2.6.2.1 连接方式的优化 | 第49-50页 |
| 2.6.2.2 首尾链连接比例的优化 | 第50-52页 |
| 2.6.2.3 连接温度的优化 | 第52-53页 |
| 2.6.2.4 连接时间的优化 | 第53-55页 |
| 2.6.2.5 连接辅助因子的优化 | 第55-57页 |
| 2.6.2.6 模块DNA浓度的优化 | 第57页 |
| 2.6.2.7 连接产物的验证 | 第57-59页 |
| 2.6.3 重聚和PCR的优化 | 第59-60页 |
| 2.6.4 重组DNA的表征 | 第60-61页 |
| 2.6.5 重组DNA的回收纯化 | 第61-62页 |
| 2.6.6 质粒载体的双酶切 | 第62-63页 |
| 2.6.7 重组质粒的转化 | 第63-64页 |
| 2.6.8 阳性克隆的筛选及鉴定 | 第64页 |
| 2.7 小结 | 第64-67页 |
| 第三章 组合文库的分析 | 第67-73页 |
| 3.1 组合文库有效性分析 | 第67页 |
| 3.2 组合文库重组情况分析 | 第67-69页 |
| 3.3 组合文库随机性分析 | 第69-73页 |
| 结论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 附录1 论文中使用的缩略词 | 第81-82页 |
| 附录2 阳性克隆测序结果 | 第82-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 | 第94-95页 |
