| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-37页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 包涵体 | 第15-21页 |
| 1.2.1 包涵体的形成 | 第16-17页 |
| 1.2.2 蛋白质的折叠复性机理 | 第17-20页 |
| 1.2.3 蛋白质折叠过程中的限速步骤 | 第20-21页 |
| 1.3 常用蛋白质体外复性方法 | 第21页 |
| 1.4 折叠酶DsbA | 第21-33页 |
| 1.4.1 DsbA的发现 | 第24页 |
| 1.4.2 Dsb家族简介及各成员的协同作用 | 第24-27页 |
| 1.4.3 DsbA的结构和性质 | 第27-33页 |
| 1.5 DsbA协助蛋白质的体内外折叠 | 第33-35页 |
| 1.5.1 DsbA协助下的体内蛋白折叠 | 第33-34页 |
| 1.5.2 DsbA协助下的体外蛋白质重折叠 | 第34-35页 |
| 1.6 本文研究思路和内容 | 第35-37页 |
| 第二章 基因工程菌发酵制备重组DsbA的杂合设计优化 | 第37-55页 |
| 2.1 引言 | 第37-38页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第38-40页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第38-39页 |
| 2.2.2 实验材料 | 第39页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第39页 |
| 2.2.4 培养基和缓冲液 | 第39-40页 |
| 2.3 分析方法 | 第40页 |
| 2.3.1 细胞生长测定 | 第40页 |
| 2.3.2 DsbA表达量测定 | 第40页 |
| 2.4 实验方法 | 第40-44页 |
| 2.4.1 重组DsbA工程菌制备 | 第40-41页 |
| 2.4.2 重组DsbA的发酵 | 第41页 |
| 2.4.3 筛选实验——Plackett-Burman设计 | 第41-42页 |
| 2.4.4 优化实验——杂合设计 | 第42-44页 |
| 2.5 数据分析 | 第44-46页 |
| 2.5.1 筛选实验的数据分析方法 | 第44-46页 |
| 2.5.2 响应面实验的数据分析方法 | 第46页 |
| 2.6 结果与讨论 | 第46-53页 |
| 2.6.1 影响重组DsbA工程菌生长与表达的因素 | 第46-47页 |
| 2.6.2 重要影响因素的选取 | 第47-49页 |
| 2.6.3 响应面拟合及最佳实验点的确定 | 第49-52页 |
| 2.6.4 最优实验点的验证 | 第52-53页 |
| 2.7 本章小结 | 第53-55页 |
| 第三章 离子交换层析纯化重组DsbA的Box-Behnken设计优化 | 第55-71页 |
| 3.1 引言 | 第55-56页 |
| 3.2 实验材料和仪器 | 第56页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第56页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第56页 |
| 3.2.3 缓冲液 | 第56页 |
| 3.3 分析方法 | 第56-58页 |
| 3.3.1 纯化后DsbA浓度的测定 | 第56-57页 |
| 3.3.2 DsbA纯化过程中的检测 | 第57页 |
| 3.3.3 DTNB法(Ellman’s法)测定自由巯基的含量 | 第57-58页 |
| 3.4 实验方法 | 第58-61页 |
| 3.4.1 菌体收集与细胞破碎 | 第58页 |
| 3.4.2 离子交换层析 | 第58-59页 |
| 3.4.3 Box-Behnken设计 | 第59页 |
| 3.4.4 重组DsbA的肽质量指纹图谱 | 第59-61页 |
| 3.5 数据分析 | 第61-62页 |
| 3.5.1 响应面实验的数据分析方法 | 第61页 |
| 3.5.2 多目标规划——功效系数法 | 第61-62页 |
| 3.6 结果与讨论 | 第62-69页 |
| 3.6.1 影响离子交换层析效果的因素 | 第62-63页 |
| 3.6.2 Box-Behnken设计的响应面拟合 | 第63-64页 |
| 3.6.3 多目标规划及最佳操作点的确定 | 第64-67页 |
| 3.6.4 最优实验点的验证 | 第67-68页 |
| 3.6.5 DsbA的肽质量指纹图谱 | 第68-69页 |
| 3.7 本章小结 | 第69-71页 |
| 第四章 游离DsbA协助溶菌酶体外复性及其动力学研究 | 第71-93页 |
| 4.1 引言 | 第71-72页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第72-73页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第72页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第72-73页 |
| 4.2.3 缓冲液 | 第73页 |
| 4.3 分析方法 | 第73-75页 |
| 4.3.1 复性后DsbA和溶菌酶的分离和定量分析 | 第73-74页 |
| 4.3.2 溶菌酶的活性测定 | 第74-75页 |
| 4.4 实验方法 | 第75-78页 |
| 4.4.1 溶菌酶的变性与复性 | 第75页 |
| 4.4.2 筛选实验——Plackett-Burman设计 | 第75-76页 |
| 4.4.3 优化实验——小型中心复合设计 | 第76-78页 |
| 4.4.4 溶菌酶复性的动力学 | 第78页 |
| 4.5 数据分析 | 第78-81页 |
| 4.5.1 筛选实验的数据分析方法 | 第78页 |
| 4.5.2 响应面实验的数据分析方法 | 第78页 |
| 4.5.3 多目标规划 | 第78页 |
| 4.5.4 溶菌酶复性的动力学模型 | 第78-81页 |
| 4.6 结果与讨论 | 第81-90页 |
| 4.6.1 影响游离DsbA协助溶菌酶体外重折叠复性的因素 | 第81-82页 |
| 4.6.2 重要影响因素的选取 | 第82-83页 |
| 4.6.3 Small CCD响应面拟合 | 第83-85页 |
| 4.6.4 多目标规划及最佳操作点的确定 | 第85-86页 |
| 4.6.5 最优实验点的验证 | 第86页 |
| 4.6.6 游离DsbA协助溶菌酶体外重折叠复性的动力学研究 | 第86-90页 |
| 4.7 本章小结 | 第90-93页 |
| 第五章 固定化DsbA协助溶菌酶体外批式复性 | 第93-107页 |
| 5.1 引言 | 第93-94页 |
| 5.2 实验材料与仪器 | 第94-95页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第94页 |
| 5.2.2 实验仪器 | 第94-95页 |
| 5.2.3 缓冲液 | 第95页 |
| 5.3 分析方法 | 第95-96页 |
| 5.3.1 溶菌酶蛋白浓度的测定 | 第95-96页 |
| 5.3.2 活性收率 | 第96页 |
| 5.4 实验方法 | 第96-98页 |
| 5.4.1 DsbA的固定化 | 第96-97页 |
| 5.4.2 固定化DsbA的稳定性测试 | 第97页 |
| 5.4.3 固定化DsbA协助溶菌酶体外批式复性 | 第97-98页 |
| 5.5 结果与讨论 | 第98-106页 |
| 5.5.1 DsbA的固定化及稳定性 | 第98页 |
| 5.5.2 初始溶菌酶浓度对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响 | 第98-99页 |
| 5.5.3 复性温度对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响 | 第99-100页 |
| 5.5.4 复性pH值对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响 | 第100-101页 |
| 5.5.5 尿素浓度对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响 | 第101-102页 |
| 5.5.6 KCl浓度对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响 | 第102-103页 |
| 5.5.7 氧化还原环境对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响 | 第103-105页 |
| 5.5.8 固定化DsbA应用于溶菌酶的多次批式复性 | 第105-106页 |
| 5.6 本章小结 | 第106-107页 |
| 第六章 固定化DsbA协助溶菌酶的柱上复性 | 第107-123页 |
| 6.1 引言 | 第107页 |
| 6.2 实验材料和仪器 | 第107-108页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第107-108页 |
| 6.2.2 实验仪器 | 第108页 |
| 6.2.3 缓冲液 | 第108页 |
| 6.3 实验方法 | 第108-110页 |
| 6.3.1 固定化DsbA协助溶菌酶的柱上复性 | 第108页 |
| 6.3.2 固定化DsbA和SEC复合柱协助溶菌酶的柱上复性 | 第108-110页 |
| 6.4 实验结果与讨论 | 第110-120页 |
| 6.4.1 SEC体积对固定化DsbA和SEC复合柱协助溶菌酶柱上复性的影响 | 第110-111页 |
| 6.4.2 预平衡模式对固定化DsbA协助溶菌酶柱上复性的影响 | 第111-113页 |
| 6.4.3 流速对固定化DsbA协助溶菌酶柱上复性的影响 | 第113-114页 |
| 6.4.4 上样方式对固定化DsbA协助溶菌酶柱上复性的影响 | 第114-116页 |
| 6.4.5 KCl浓度对固定化DsbA协助溶菌酶柱上复性的影响 | 第116-117页 |
| 6.4.6 固定化DsbA协助溶菌酶柱上复性的重复利用 | 第117-119页 |
| 6.4.7 几种具有代表性的溶菌酶柱上复性方法的对比 | 第119-120页 |
| 6.5 本章小结 | 第120-123页 |
| 第七章 溶菌酶热变性分子模拟初探 | 第123-135页 |
| 7.1 引言 | 第123-124页 |
| 7.2 实验材料和仪器 | 第124-125页 |
| 7.2.1 模拟设备 | 第124页 |
| 7.2.2 模拟软件 | 第124-125页 |
| 7.2.3 模拟对象 | 第125页 |
| 7.3 分析方法 | 第125-127页 |
| 7.3.1 均方根偏差RMSD(root mean square deviation) | 第125-126页 |
| 7.3.2 分子内氢键数Nh(number of hydrogen bonds) | 第126页 |
| 7.3.3 分子回转半径Rg(radius of gyration) | 第126-127页 |
| 7.4 模拟与计算 | 第127-128页 |
| 7.4.1 溶菌酶热变性过程的分子模拟 | 第127页 |
| 7.4.2 溶菌酶在8M尿素溶液中周期性边界系统的构建 | 第127页 |
| 7.4.3 溶菌酶在8M尿素溶液中700K下热变性过程的分子模拟 | 第127-128页 |
| 7.5 实验结果与讨论 | 第128-133页 |
| 7.5.1 溶菌酶分子在373K下的热变性 | 第128页 |
| 7.5.2 溶菌酶分子在500K、700K和900K下的热变性 | 第128-131页 |
| 7.5.4 溶菌酶在8M尿素溶液中的周期性边界系统 | 第131-132页 |
| 7.5.5 溶菌酶在8M尿素溶液中700K下的热变性 | 第132-133页 |
| 7.6 本章小结 | 第133-135页 |
| 第八章 结论与展望 | 第135-139页 |
| 8.1 结论 | 第135-137页 |
| 8.2 展望 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-149页 |
| 主要符号注释表 | 第149-151页 |
| 主要略语注释表 | 第151-153页 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 | 第153-155页 |
| 作者简介 | 第155页 |
