| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 前言 | 第11-22页 |
| 1 布鲁氏菌 | 第11-14页 |
| 1.1 布鲁氏菌病的研究史 | 第11页 |
| 1.2 布鲁氏菌的致病机制 | 第11-12页 |
| 1.3 布鲁氏菌的毒力因子 | 第12-14页 |
| 1.3.1 LPS | 第12页 |
| 1.3.2 环状β-(1,2)-葡聚糖(CβP) | 第12-13页 |
| 1.3.3 外膜蛋白 | 第13页 |
| 1.3.4 Ⅳ型分泌系统 | 第13-14页 |
| 1.4 布鲁氏菌病的诊断与防治 | 第14页 |
| 2 小分子RNA(microRNA)研究进展 | 第14-22页 |
| 2.1 miRNAs的合成与成熟 | 第14-17页 |
| 2.2 miRNAs的检测 | 第17-20页 |
| 2.2.1 Northern blot | 第17页 |
| 2.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction, qRT-PCR) | 第17-19页 |
| 2.2.3 miRNAs芯片 | 第19-20页 |
| 2.2.4 高通量测序 | 第20页 |
| 2.3 miRNAs靶基因的预测 | 第20-22页 |
| 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 B.melitensis M5-90-△wbkC缺失株的构建 | 第23-42页 |
| 1 实验材料 | 第23-26页 |
| 1.1 菌株 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂 | 第23-24页 |
| 1.3 仪器 | 第24页 |
| 1.4 试剂配方 | 第24-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-36页 |
| 2.1 B.melitensis M5-90基因组的提取 | 第26页 |
| 2.2 wbkC基因左右臂及Kana~r基因的引物的设计 | 第26-27页 |
| 2.3 B.melitensis M5-90-△wbkC缺失株的构建 | 第27-36页 |
| 2.3.1 wbkC左臂(N端)扩增 | 第27页 |
| 2.3.2 wbkC右臂(C端)扩增 | 第27-28页 |
| 2.3.3 Kana~r基因扩增 | 第28页 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第28页 |
| 2.3.5 DNA凝胶回收 | 第28页 |
| 2.3.6 目的片段与pMD20T载体连接 | 第28-29页 |
| 2.3.7 感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.3.8 pMD20-T重组质粒转化至DH5α | 第29页 |
| 2.3.9 菌落PCR筛选阳性克隆重组质粒 | 第29-30页 |
| 2.3.10 摇菌质粒提取 | 第30页 |
| 2.3.11 重组质粒酶切 | 第30-31页 |
| 2.3.12 自杀载体pGEM-7Zf-wbkC-N的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.13 自杀载体pGEM-7Zf-wbkC-N-Kana~r的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.14 自杀载体pGEM-7Zf-wbkC-N-Kana~r-wbkC-C的构建 | 第33-35页 |
| 2.3.15 M5-90感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 2.3.16 电转化M5-90感受态细胞 | 第35页 |
| 2.3.17 B.melitensis M5-90-△wbkC的筛选 | 第35页 |
| 2.3.18 B.melitensis M5-90-△wbkC的PCR鉴定稳定遗传菌 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-41页 |
| 3.1 PCR扩增wbkC-N、Kana~r、wbkC-C片段 | 第36页 |
| 3.2 pMD20-T-wbkC-N、pMD20-T-Kana~r、pMD20-T-wbkC-N重组质粒酶切 | 第36-37页 |
| 3.3 重组质粒pGEM-7Zf-△wbkC酶切获得wbkC-N、Kana~r、wbkC-C片段 | 第37-38页 |
| 3.4 重组质粒pGEM-7Zf-△wbkC酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 3.5 wbkC缺失基因检测 | 第39-40页 |
| 3.6 B.melitensis M5-90-△wbkC稳定遗传鉴定 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41页 |
| 5 结论 | 第41-42页 |
| 第三章 感染B.melitensis M5-90-△wbkC株的RAW264.7细胞中差异表达miRNAs的鉴定 | 第42-53页 |
| 1 材料与方法 | 第42-44页 |
| 1.1 实验材料 | 第42-43页 |
| 1.1.1 细胞 | 第42页 |
| 1.1.2 菌种 | 第42-43页 |
| 1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 1.3 实验仪器 | 第43页 |
| 1.4 主要试剂的配置 | 第43-44页 |
| 2 | 第44-47页 |
| 2.1 实验方法 | 第44-47页 |
| 2.1.1 细胞复苏 | 第44页 |
| 2.1.2 细胞传代 | 第44页 |
| 2.1.3 细胞冻存 | 第44-45页 |
| 2.1.4 菌液复苏 | 第45页 |
| 2.1.5 菌液收集 | 第45页 |
| 2.1.6 感染RAW264.7细胞 | 第45页 |
| 2.1.7 提取总RNA | 第45-46页 |
| 2.1.8 总RNA甲醛变性胶电泳 | 第46页 |
| 2.1.9 miRNA Microarray-Single芯片实验 | 第46页 |
| 2.1.10 qRT-PCR验证 | 第46-47页 |
| 3 实验结果 | 第47-52页 |
| 3.1 总RNA检测 | 第47-48页 |
| 3.2 miRNAs芯片分析热图 | 第48-50页 |
| 3.3 qRT-PCR验证差异miRNAs结果 | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52页 |
| 5 结论 | 第52-53页 |
| 第四章 感染B.melitensis M5-90-△wbkC株的RAW264.7细胞的基因表达谱分析 | 第53-65页 |
| 1 实验材料 | 第53页 |
| 1.1 材料 | 第53页 |
| 1.2 主要试剂 | 第53页 |
| 1.3 仪器 | 第53页 |
| 1.4 常用试剂配制 | 第53页 |
| 2 实验方法 | 第53-55页 |
| 2.1 细胞培养 | 第53页 |
| 2.2 菌株培养 | 第53页 |
| 2.3 菌株感染细胞 | 第53页 |
| 2.4 提取RNA | 第53-54页 |
| 2.5 RNA检测 | 第54页 |
| 2.6 Agilent基因样品制备 | 第54-55页 |
| 2.7 芯片结果分析 | 第55页 |
| 2.8 差异表达miRNA靶基因预测 | 第55页 |
| 3 结果分析 | 第55-64页 |
| 3.1 表达谱芯片数据图 | 第55-61页 |
| 3.2 差异表达miRNA的靶基因预测 | 第61-64页 |
| 4 讨论 | 第64页 |
| 5 结论 | 第64-65页 |
| 创新点 | 第65页 |
| 全文结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 缩略语表 | 第74-75页 |
| 附录 | 第75-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
