| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-28页 |
| 1.1 醇脱氢酶催化体系 | 第11-13页 |
| 1.1.1 醇脱氢酶概述 | 第11页 |
| 1.1.2 醇脱氢酶的立体选择性 | 第11-12页 |
| 1.1.3 醇脱氢酶的外源表达及优化策略 | 第12-13页 |
| 1.2 醇脱氢酶的结构解析及催化机制 | 第13-19页 |
| 1.2.1 生物大分子的结构解析 | 第13-15页 |
| 1.2.2 中链醇脱氢酶的晶体结构解析 | 第15-18页 |
| 1.2.3 中链醇脱氢酶的分子催化机制 | 第18-19页 |
| 1.3 酶的分子改造 | 第19-22页 |
| 1.3.1 酶的分子改造的发展 | 第19-21页 |
| 1.3.2 基于结构的酶立体选择性的改造 | 第21-22页 |
| 1.3.3 基于结构的酶底物特异性的改造 | 第22页 |
| 1.4 醇脱氢酶制备手性化合物 | 第22-25页 |
| 1.4.1 手性和手性化合物 | 第22-23页 |
| 1.4.2 醇脱氢酶的辅酶循环 | 第23-24页 |
| 1.4.3 醇脱氢酶制备手性醇类化合物 | 第24-25页 |
| 1.5 本课题立题依据及研究意义 | 第25-28页 |
| 1.5.1 关键科学问题 | 第25-26页 |
| 1.5.2 研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 (R)-专一性醇脱氢酶的外源表达优化 | 第28-35页 |
| 2.1 前言 | 第28页 |
| 2.2 材料与方法 | 第28-31页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第28页 |
| 2.2.2 培养基 | 第28页 |
| 2.2.3 主要试剂和仪器 | 第28页 |
| 2.2.4 酵母菌体培养及基因组的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.5 基因克隆与 mRNA 翻译起始区二级结构的优化 | 第29-30页 |
| 2.2.6 重组菌株的构建 | 第30页 |
| 2.2.7 目的蛋白的表达 | 第30页 |
| 2.2.8 粗酶液活力的测定 | 第30页 |
| 2.2.9 全细胞不对称转化 | 第30-31页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第31-34页 |
| 2.3.1 mRNA 翻译起始区二级结构的优化 | 第31页 |
| 2.3.2 优化型基因的克隆及重组质粒的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.3 优化后显著提高目的蛋白的表达水平 | 第32页 |
| 2.3.4 优化前后酶蛋白还原活力的比较 | 第32-33页 |
| 2.3.5 全细胞不对称转化效率的提高 | 第33-34页 |
| 2.4 本章小结 | 第34-35页 |
| 第三章 (R)-专一性醇脱氢酶的结构解析及分子催化机制 | 第35-53页 |
| 3.1 前言 | 第35页 |
| 3.2 材料与方法 | 第35-40页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第35页 |
| 3.2.2 培养基 | 第35-36页 |
| 3.2.3 主要试剂和仪器 | 第36页 |
| 3.2.4 表达菌株的构建 | 第36页 |
| 3.2.5 目的蛋白的表达 | 第36页 |
| 3.2.6 目的蛋白的纯化 | 第36-38页 |
| 3.2.7 酶活力的测定 | 第38页 |
| 3.2.8 目的蛋白的结晶 | 第38页 |
| 3.2.9 X-光衍射数据的收集与处理 | 第38-39页 |
| 3.2.10 晶体结构的解析 | 第39页 |
| 3.2.11 分子对接模拟酶-辅酶-底物三元复合体的结构 | 第39-40页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第40-52页 |
| 3.3.1 (R)-专一性醇脱氢酶及突变体的表达与纯化 | 第40-42页 |
| 3.3.2 (R)-专一性醇脱氢酶与辅酶共结晶条件的筛选和优化 | 第42-44页 |
| 3.3.3 (R)-专一性醇脱氢酶突变体 H49A 与辅酶共结晶条件的筛选和优化 | 第44-45页 |
| 3.3.4 X-光衍射数据的收集与处理 | 第45-46页 |
| 3.3.5 (R)-专一性醇脱氢酶与辅酶、底物以及产物的复合体结构解析 | 第46-48页 |
| 3.3.6 (R)-专一性醇脱氢酶的晶体结构分析 | 第48-51页 |
| 3.3.7 (R)-专一性醇脱氢酶的立体选择性分子催化机制 | 第51-52页 |
| 3.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 基于结构的(R)-专一性醇脱氢酶的立体选择性分子调控 | 第53-62页 |
| 4.1 前言 | 第53-54页 |
| 4.2 材料与方法 | 第54-56页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第54页 |
| 4.2.2 培养基 | 第54页 |
| 4.2.3 主要试剂和仪器 | 第54页 |
| 4.2.4 (R)-专一性醇脱氢酶突变体的构建 | 第54-55页 |
| 4.2.5 目的蛋白的表达和纯化 | 第55页 |
| 4.2.6 不对称还原芳香酮及产物的对映体分析 | 第55页 |
| 4.2.7 模拟(R)-专一性醇脱氢酶及突变体与底物的结合模型 | 第55-56页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第56-61页 |
| 4.3.1 已解析结构中链醇脱氢酶的立体选择性比较 | 第56页 |
| 4.3.2 酶的底物结合口袋分析 | 第56-57页 |
| 4.3.3 基于结构的突变体设计 | 第57-59页 |
| 4.3.4 突变体的立体选择性反转 | 第59-60页 |
| 4.3.5 分子模型解释立体选择性反转的分子机制 | 第60-61页 |
| 4.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第五章 基于结构的(R)-专一性醇脱氢酶的底物特异性分子调控 | 第62-72页 |
| 5.1 前言 | 第62页 |
| 5.2 材料与方法 | 第62-64页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第62页 |
| 5.2.2 培养基 | 第62-63页 |
| 5.2.3 主要试剂和仪器 | 第63页 |
| 5.2.4 (R)-专一性醇脱氢酶突变体的构建 | 第63页 |
| 5.2.5 目的蛋白的表达和纯化 | 第63页 |
| 5.2.6 动力学参数的测定 | 第63-64页 |
| 5.2.7 底物特异性分析及还原产物的对映体分析 | 第64页 |
| 5.2.8 模拟(R)-专一性醇脱氢酶及突变体与底物的结合模型 | 第64页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第64-71页 |
| 5.3.1 野生型酶的底物特异性规律 | 第64-66页 |
| 5.3.2 底物结合口袋中突变位点的设计 | 第66-68页 |
| 5.3.3 突变酶与野生酶催化性能的比较 | 第68-69页 |
| 5.3.4 突变酶对立体选择性的影响 | 第69-70页 |
| 5.3.5 分子模型解释底物特异性改变的分子机制 | 第70-71页 |
| 5.4 本章小结 | 第71-72页 |
| 第六章 双辅助底物耦联辅酶再生系统的构建及转化应用 | 第72-80页 |
| 6.1 前言 | 第72页 |
| 6.2 材料与方法 | 第72-74页 |
| 6.2.1 培养基 | 第72页 |
| 6.2.2 主要试剂和仪器 | 第72页 |
| 6.2.3 菌体培养和目的蛋白的表达 | 第72-73页 |
| 6.2.4 粗酶液和纯酶的制备 | 第73页 |
| 6.2.5 粗酶液和纯酶的氧化还原活力的测定 | 第73页 |
| 6.2.6 重组菌全细胞不对称转化 | 第73页 |
| 6.2.7 构建辅酶循环系统 | 第73页 |
| 6.2.8 优化反应时间和底物浓度 | 第73页 |
| 6.2.9 反应过程中胞内 NADH/NAD+比率的定量 | 第73-74页 |
| 6.2.10 反应过程中的细胞活性的检测 | 第74页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第74-79页 |
| 6.3.1 构建单底物耦联辅酶再生系统 | 第74-76页 |
| 6.3.2 构建双底物耦联辅酶再生系统 | 第76页 |
| 6.3.3 有效提高生产强度和底物浓度 | 第76页 |
| 6.3.4 粗酶液和纯酶的氧化还原活性是辅酶循环的基础 | 第76-78页 |
| 6.3.5 异丙醇和甘油对胞内辅酶 NADH/NAD+比率和细胞活性的影响 | 第78-79页 |
| 6.4 本章小结 | 第79-80页 |
| 主要结论与展望 | 第80-83页 |
| 主要结论 | 第80-82页 |
| 展望 | 第82-83页 |
| 论文创新点 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-95页 |
| 附录：表 | 第95-99页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第99-100页 |
