| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1 前言 | 第10-19页 |
| 1.1 课题的提出 | 第10-11页 |
| 1.2 前人研究进展 | 第11-17页 |
| 1.2.1 有色体研究概况 | 第11页 |
| 1.2.2 质体小球研究概况 | 第11-15页 |
| 1.2.2.1 质体小球组成及特征 | 第11-12页 |
| 1.2.2.2 质体小球形成机制 | 第12-14页 |
| 1.2.2.3 质体小球的功能 | 第14-15页 |
| 1.2.3 ABC1K类基因研究概况 | 第15-17页 |
| 1.2.3.1 ABC1K类基因的发展历程 | 第15页 |
| 1.2.3.2 ABC1K类基因的功能 | 第15-17页 |
| 1.3 研究目的和研究内容 | 第17-18页 |
| 1.3.1 研究目的 | 第17页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第17-18页 |
| 1.4 技术路线 | 第18-19页 |
| 2 实验材料 | 第19-20页 |
| 2.1 植物材料、菌株和载体 | 第19页 |
| 2.2 主要试剂和酶 | 第19-20页 |
| 2.3 主要试验仪器 | 第20页 |
| 2.4 培养基配方 | 第20页 |
| 3 实验方法 | 第20-33页 |
| 3.1 目的基因cDNA的克隆、阳性鉴定及测序 | 第20-23页 |
| 3.1.1 总RNA提取 | 第20页 |
| 3.1.2 反转录 | 第20-21页 |
| 3.1.3 引物设计 | 第21-22页 |
| 3.1.4 目的基因克隆 | 第22页 |
| 3.1.5 目的片段回收 | 第22-23页 |
| 3.1.6 TA克隆 | 第23页 |
| 3.1.7 转化大肠杆菌 | 第23页 |
| 3.1.8 阳性克隆检测及测序 | 第23页 |
| 3.2 CsABC1K类基因超量载体的构建 | 第23-26页 |
| 3.2.1 含目的基因全长的质粒DNA提取 | 第23页 |
| 3.2.2 含特异重组位点的目的基因克隆 | 第23-25页 |
| 3.2.3 目的片段回收 | 第25页 |
| 3.2.4 BP反应 | 第25页 |
| 3.2.5 检测BP反应阳性克隆及测序 | 第25页 |
| 3.2.6 LR反应 | 第25-26页 |
| 3.2.7 LR反应阳性克隆检测及测序 | 第26页 |
| 3.3 重组质粒转化根癌农杆菌EHA105 | 第26-27页 |
| 3.3.1 农杆菌感受态的制备 | 第26页 |
| 3.3.2 转化农杆菌 | 第26页 |
| 3.3.3 农杆菌单克隆阳性鉴定 | 第26-27页 |
| 3.4 CsABC1K类基因干涉载体的构建 | 第27-30页 |
| 3.4.1 筛选特异引物 | 第27-28页 |
| 3.4.2 人工合成含目的基因反向互补序列及特异重组位点attB的片段 | 第28-29页 |
| 3.4.3 BP反应及阳性克隆鉴定、测序 | 第29页 |
| 3.4.4 LR反应及阳性克隆鉴定、测序 | 第29-30页 |
| 3.4.5 转化农杆菌及阳性克隆鉴定 | 第30页 |
| 3.5 农杆菌介导遗传转化柑橘胚性愈伤组织 | 第30页 |
| 3.6 阳性愈伤鉴定 | 第30-31页 |
| 3.6.1 小量法提取愈伤组织DNA | 第30页 |
| 3.6.2 基因组DNA的PCR检测 | 第30-31页 |
| 3.7 实时荧光定量PCR | 第31-32页 |
| 3.7.1 RNA的提取及反转录 | 第31页 |
| 3.7.2 设计实时荧光定量PCR引物 | 第31-32页 |
| 3.7.3 实时荧光定量PCR反应 | 第32页 |
| 3.8 拟南芥逆境处理 | 第32-33页 |
| 3.8.1 干旱处理 | 第32页 |
| 3.8.2 MV处理 | 第32-33页 |
| 3.8.3 NaCl处理 | 第33页 |
| 3.8.4 甘露醇处理 | 第33页 |
| 4 结果与分析 | 第33-49页 |
| 4.1 柑橘ABC1K1,3,6,9基因的cDNA克隆 | 第33-34页 |
| 4.1.1 红暗柳橙总RNA的提取 | 第33-34页 |
| 4.1.2 CsABC1K1,3,6,9基因cDNA的RT-PCR扩增 | 第34页 |
| 4.2 柑橘CsABC1K类基因超量表达载体的构建 | 第34-38页 |
| 4.2.1 CsABC1K1,3,6,9基因含特异重组位点的克隆 | 第34-36页 |
| 4.2.2 BP反应阳性克隆鉴定 | 第36页 |
| 4.2.3 LR反应阳性克隆鉴定 | 第36-37页 |
| 4.2.4 农杆菌PCR阳性鉴定 | 第37-38页 |
| 4.3 柑橘ABC1K类基因抑制表达载体的构建 | 第38-41页 |
| 4.3.1 人工合成含有目的基因反向互补序列的片段 | 第38-39页 |
| 4.3.2 BP反应阳性克隆鉴定 | 第39-40页 |
| 4.3.3 LR反应阳性克隆鉴定 | 第40-41页 |
| 4.3.4 农杆菌PCR阳性鉴定 | 第41页 |
| 4.4 转基因材料的获得 | 第41-42页 |
| 4.5 转基因愈伤的阳性鉴定 | 第42-44页 |
| 4.6 实时荧光定量PCR | 第44-46页 |
| 4.6.1 ABC1K类基因在转基因愈伤中的表达量分析 | 第44-45页 |
| 4.6.2 CsABC1K类基因在转基因拟南芥中的表达量分析 | 第45-46页 |
| 4.7 转基因系拟南芥的抗逆性研究 | 第46-49页 |
| 4.7.1 干旱处理 | 第46-47页 |
| 4.7.2 MV处理 | 第47-48页 |
| 4.7.3 盐胁迫处理 | 第48-49页 |
| 4.7.4 甘露醇处理 | 第49页 |
| 5 讨论 | 第49-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
