| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略语 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-23页 |
| 1 TBC家族蛋白的研究概况 | 第12-14页 |
| 1.1 TBC家族蛋白 | 第12-13页 |
| 1.2 TBC1D15蛋白的功能研究 | 第13页 |
| 1.3 条纹斑竹鲨TBC1D15蛋白的研究进展 | 第13-14页 |
| 2 含GAP结构域蛋白的结构研究 | 第14-17页 |
| 3 Rab7和Rab11蛋白的研究概况 | 第17-18页 |
| 3.1 Rab7 | 第17页 |
| 3.2 Rab11 | 第17-18页 |
| 4 蛋白质X射线衍射晶体学概况 | 第18-19页 |
| 4.1 生物大分子的结构研究方法 | 第18页 |
| 4.2 蛋白质结晶技术 | 第18-19页 |
| 5 实验方案 | 第19-23页 |
| 5.1 实验目的和意义 | 第19-20页 |
| 5.2 课题研究内容 | 第20-22页 |
| 5.3 实验流程 | 第22-23页 |
| 第二章 TBC1D15 GAP domain蛋白的克隆、表达和纯化 | 第23-37页 |
| 1 材料与试剂 | 第23-26页 |
| 1.1 材料 | 第23页 |
| 1.2 试剂 | 第23-26页 |
| 2 方法 | 第26-32页 |
| 2.1 TBC1D15的氨基酸序列分析 | 第26-27页 |
| 2.2 TBC1D15 GAP domain截短的引物设计 | 第27-29页 |
| 2.3 目的基因的PCR扩增 | 第29页 |
| 2.4 PCR扩增产物/载体双酶切产物纯化回收 | 第29页 |
| 2.5 连接反应 | 第29-30页 |
| 2.6 E.coli Top10、E.coli BL21（DE3）感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.7 连接产物的转化 | 第30页 |
| 2.8 重组质粒的提取和鉴定 | 第30-31页 |
| 2.9 重组质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞 | 第31页 |
| 2.10 融合蛋白的小量表达与纯化 | 第31页 |
| 2.11 融合蛋白SDS-PAGE电泳检测 | 第31-32页 |
| 2.12 HPLC分析蛋白性状 | 第32页 |
| 3 结果 | 第32-36页 |
| 3.1 His SUMO Sus RabGAP-1、His SUMO Sus RabGAP-2 和His SUMO Sus GAP-1的纯化鉴定 | 第32-33页 |
| 3.2 His SUMO Mus RabGAP-1、His SUMO Mus RabGAP-2 和His SUMO Mus GAP-1的纯化鉴定 | 第33页 |
| 3.3 His SUMO Sus GAP-2 和His SUMO Mus GAP-2 的纯化鉴定 | 第33-34页 |
| 3.4 His SUMO Shark RabGAP-1、His SUMO Shark RabGAP-2 和His SUMO SharkGAP-1 的纯化鉴定 | 第34-35页 |
| 3.5 His SUMO Homo RabGAP-1、His SUMO Homo RabGAP-2 和His SUMO HomoGAP-1 的纯化鉴定 | 第35页 |
| 3.6 His SUMO Shark GAP-2 和His SUMO Homo GAP-2 的纯化鉴定 | 第35-36页 |
| 3.7 对His SUMO Sus GAP-2、His SUMO Mus GAP-2、His SUMO Shark GAP-2 和His SUMO Homo GAP-2 进行HPLC分析 | 第36页 |
| 4 讨论 | 第36-37页 |
| 第三章 蛋白结晶条件的初筛及优化 | 第37-48页 |
| 1 材料与试剂 | 第37-38页 |
| 1.1 材料与仪器 | 第37页 |
| 1.2 试剂 | 第37-38页 |
| 2 方法 | 第38-40页 |
| 2.1 Sus GAP-2、Mus GAP-2、Shark GAP-2 和Homo GAP-2 的大量表达和纯化 | 第38-39页 |
| 2.2 融合蛋白的酶切和过二次Ni柱 | 第39页 |
| 2.3 FPLC进一步提高蛋白纯度 | 第39页 |
| 2.4 蛋白结晶条件的初筛 | 第39页 |
| 2.5 蛋白结晶条件的优化 | 第39-40页 |
| 3 实验结果 | 第40-47页 |
| 3.1 融合蛋白SDS-PAGE鉴定 | 第40-42页 |
| 3.2 蛋白结晶条件的初筛 | 第42-45页 |
| 3.3 蛋白晶体优化 | 第45-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 第四章 蛋白晶体衍射与结构解析 | 第48-55页 |
| 1 材料与试剂 | 第48页 |
| 1.1 材料 | 第48页 |
| 1.2 试剂 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-49页 |
| 2.1 蛋白晶体的冻存 | 第48页 |
| 2.2 X-ray蛋白晶体衍射 | 第48页 |
| 2.3 结构解析 | 第48-49页 |
| 2.4 结构分析 | 第49页 |
| 3 结果 | 第49-53页 |
| 3.1 Sus GAP-2 和Shark GAP-2 衍射图谱 | 第49页 |
| 3.2 Shark GAP-2 和Sus GAP-2 衍射数据 | 第49-50页 |
| 3.3 结构分析 | 第50-53页 |
| 3.4 蛋白结构注册 | 第53页 |
| 4 讨论 | 第53-55页 |
| 第五章 Shark GAP-2、Sus GAP-2 及其突变体的GAP活性研究 | 第55-63页 |
| 1 材料、仪器与试剂 | 第55页 |
| 1.1 材料与仪器 | 第55页 |
| 1.2 试剂 | 第55页 |
| 2 方法 | 第55-59页 |
| 2.1 点突变引物的设计 | 第55-56页 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 | 第56-57页 |
| 2.3 DpnI消化PCR产物 | 第57页 |
| 2.4 消化产物重组 | 第57页 |
| 2.5 转化 | 第57页 |
| 2.6 重组质粒的提取和鉴定 | 第57页 |
| 2.7 融合蛋白的小量表达与纯化 | 第57页 |
| 2.8 突变体蛋白SDS-PAGE电泳检测 | 第57页 |
| 2.9 Rab·GTP复合物的制备 | 第57-58页 |
| 2.10 磷含量标准曲线的制作 | 第58页 |
| 2.11 Shark GAP-2、Sus GAP-2 及其突变体的GAP活性测定 | 第58页 |
| 2.12 从结构角度分析关键氨基酸对GAP活性的影响 | 第58-59页 |
| 3 结果 | 第59-61页 |
| 3.1 SDS-PAGE蛋白电泳鉴定 | 第59页 |
| 3.2 Pi含量标准曲线 | 第59页 |
| 3.3 Shark GAP-2、Sus GAP-2 及其突变体的GAP活性测定 | 第59-60页 |
| 3.4 Shark GAP-2、Sus GAP-2 及其突变体的kcat/Km值 | 第60页 |
| 3.5 从结构角度分析Shark GAP-2 和Sus GAP-2 的GAP活性 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| 第六章 Shark GAP-2/Sus GAP-2 与Rab7a/Rab11a复合物结构研究 | 第63-72页 |
| 1 材料与试剂 | 第63页 |
| 1.1 材料 | 第63页 |
| 1.2 试剂 | 第63页 |
| 2 方法 | 第63-64页 |
| 2.1 重组质粒的构建 | 第63页 |
| 2.2 目的蛋白的小量表达与纯化 | 第63-64页 |
| 2.3 目的蛋白的大量表达、纯化与结晶 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-70页 |
| 3.1 Sus GAP I_(286)-A_(674)和Shark GAP L_(307)-E_(710)蛋白 | 第64页 |
| 3.2 Sus GAP I_(286)-N_(630)、Sus GAP I_(286)-A650和Sus GAP I_(286)-R_(670)蛋白 | 第64-65页 |
| 3.3 Shark GAP L_(307)-E_(710)与Rab7a及Rab11a进行共表达 | 第65-66页 |
| 3.4 Shark GAP L_(307)-E_(710)/Sus GAP I_(286)-R_(670)与Rab7a/Rab11a进行串联表达 | 第66-67页 |
| 3.5 His SUMO Sus GAP I_(286)-R_(670)+3GSA+Rab7a/Rab11a、His SUMO Shark GAPL_(307)-E_(710)+3GSA+Rab7a/Rab11a的FPLC结果 | 第67-70页 |
| 3.6 Sus GAP I_(286)-R_(670)+3GSA+Rab7a/Rab11a和Shark GAPL_(307)-E_(710)+3GSA+Rab7a/Rab11a的HPLC结果 | 第70页 |
| 4 讨论 | 第70-72页 |
| 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
