| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第12-32页 |
| 1.1 前言 | 第12-13页 |
| 1.2 链霉菌自身耐药机制研究进展 | 第13-25页 |
| 1.2.1 酶促反应使抗生素失活 | 第14-18页 |
| 1.2.2 取代或修饰细胞内抗生素作用靶点 | 第18-20页 |
| 1.2.3 转运蛋白高效外排抗生素底物 | 第20-25页 |
| 1.3 链霉菌中转运蛋白的调控应答机制研究进展 | 第25-26页 |
| 1.4 多烯类抗生素及其合成基因簇内转运蛋白研究进展 | 第26-28页 |
| 1.5 纳他霉素研究进展 | 第28-30页 |
| 1.6 本文的研究内容及意义 | 第30-32页 |
| 第2章 恰塔努加链霉菌中纳他霉素转运网络的构建 | 第32-68页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 实验材料 | 第33-36页 |
| 2.2.1 菌株 | 第33-34页 |
| 2.2.2 质粒 | 第34-35页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第35页 |
| 2.2.4 引物 | 第35-36页 |
| 2.3 培养基和常用试剂 | 第36-37页 |
| 2.3.1 培养基 | 第36页 |
| 2.3.2 常用试剂 | 第36-37页 |
| 2.4 实验方法 | 第37-44页 |
| 2.4.1 相关序列生物信息学分析的软件和方法 | 第37页 |
| 2.4.2 基本分子生物学实验技术 | 第37-38页 |
| 2.4.3 恰塔努加链霉菌基因组DNA的抽提 | 第38页 |
| 2.4.4 恰塔努加链霉菌孢子悬液的制备 | 第38-39页 |
| 2.4.5 大肠杆菌黏粒抽提 | 第39页 |
| 2.4.6 恰塔努加链霉菌和E.coliET12567的属接合转导 | 第39-40页 |
| 2.4.7 PCR-targeting基因敲除 | 第40-42页 |
| 2.4.8 恰塔努加链霉菌纳他霉素摇瓶发酵和产量分析 | 第42-43页 |
| 2.4.9 RNA的抽提、基因组DNA的消解、反转录及qRT-PCR | 第43页 |
| 2.4.10 基因芯片表达谱实验 | 第43-44页 |
| 2.5 实验结果 | 第44-65页 |
| 2.5.1 纳他霉素合成基因簇内scnA和scnB的生物信息学分析 | 第44-45页 |
| 2.5.2 多烯类抗生素合成基因簇中转运蛋白结构分析 | 第45-47页 |
| 2.5.3 ⊿scnA、⊿scnB、⊿scnAB构建及验证 | 第47-49页 |
| 2.5.4 ⊿scnA、⊿scnB、⊿scnAB的功能验证 | 第49-51页 |
| 2.5.5 基因芯片筛选其他的纳他霉素转运蛋白 | 第51-53页 |
| 2.5.6 nepⅠ、nepⅡ和mfs1的生物信息学分析 | 第53-54页 |
| 2.5.7 nepⅠ、nepⅡ和mfs1相关缺失菌株构建 | 第54-55页 |
| 2.5.8 NepⅠ/Ⅱ和Mfs1的功能研究 | 第55-58页 |
| 2.5.9 ScnA、ScnB转运纳他霉素工作形式体内验证 | 第58-61页 |
| 2.5.10 回补菌株构建及其发酵验证 | 第61-63页 |
| 2.5.11 mfsⅠ和nepⅡ普遍存在于多种链霉菌中 | 第63-65页 |
| 2.6 小结与讨论 | 第65-68页 |
| 第3章 纳他霉素转运网络的调控应答机制研究 | 第68-91页 |
| 3.1 引言 | 第68-69页 |
| 3.2 实验材料 | 第69-72页 |
| 3.2.1 菌株 | 第69-70页 |
| 3.2.2 质粒 | 第70-71页 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 | 第71页 |
| 3.2.4 引物 | 第71-72页 |
| 3.3 培养基和常用试剂 | 第72-73页 |
| 3.3.1 培养基 | 第72页 |
| 3.3.2 常用试剂 | 第72-73页 |
| 3.4 实验方法 | 第73-76页 |
| 3.4.1 生物信息学分析 | 第73页 |
| 3.4.2 基本分子生物学操作 | 第73页 |
| 3.4.3 基因敲除 | 第73页 |
| 3.4.4 恰塔努加链霉菌纳他霉素摇瓶发酵和产量分析 | 第73页 |
| 3.4.5 RNA抽提、基因组DNA消解、反转录和qRT-PCR | 第73-74页 |
| 3.4.6 重组蛋白诱导表达、纯化和透析 | 第74-75页 |
| 3.4.7 凝胶阻止实验(EMSA) | 第75页 |
| 3.4.8 亲和分离与DNA相互作用蛋白 | 第75-76页 |
| 3.5 实验结果 | 第76-89页 |
| 3.5.1 scnAB调控机制综述 | 第76-77页 |
| 3.5.2 mfo1生物信息学分析 | 第77页 |
| 3.5.3 mfo1缺失菌株构建与验证 | 第77-78页 |
| 3.5.4 mfo1缺失对纳他霉素转运基因转录水平的影响 | 第78页 |
| 3.5.5 mfo1缺失对纳他霉素产量影响 | 第78-79页 |
| 3.5.6 EMSA验证Mfo1对mfs1的调控作用 | 第79-81页 |
| 3.5.7 Mfo1的小分子应答效应 | 第81-82页 |
| 3.5.8 nreⅠ的生物信息学分析 | 第82页 |
| 3.5.9 nreⅠ缺失菌株构建与验证 | 第82-83页 |
| 3.5.10 nreⅠ缺失对纳他霉素转运基因转录水平的影响 | 第83-84页 |
| 3.5.11 nreⅠ缺失对纳他霉素产量的影响 | 第84页 |
| 3.5.12 EMSA验证NreⅠ对nepⅠ/Ⅱ的调控作用 | 第84-86页 |
| 3.5.13 DNA亲和分离方法捕获结合在nepⅠ上游的蛋白 | 第86-89页 |
| 3.6 讨论与小结 | 第89-91页 |
| 第4章 纳他霉素合成前体转运机制的初步研究 | 第91-108页 |
| 4.1 引言 | 第91-92页 |
| 4.2 实验材料 | 第92-93页 |
| 4.2.1 菌株 | 第92页 |
| 4.2.2 质粒 | 第92-93页 |
| 4.2.3 主要仪器和设备 | 第93页 |
| 4.2.4 引物 | 第93页 |
| 4.3 培养基及培养条件 | 第93页 |
| 4.4 常用试剂 | 第93页 |
| 4.5 实验方法 | 第93-94页 |
| 4.5.1 基本分子生物学操作 | 第93页 |
| 4.5.2 基因敲除 | 第93页 |
| 4.5.3 纳他霉素合成前体的摇瓶发酵和产量分析 | 第93页 |
| 4.5.4 RNA抽提,基因组消解,反转录,qRT-PCR | 第93-94页 |
| 4.5.5 EMSA | 第94页 |
| 4.5.6 4,5-脱环氧纳他霉素的分离纯化 | 第94页 |
| 4.5.7 恰塔努加链霉菌的药物敏感性实验 | 第94页 |
| 4.6 实验结果 | 第94-105页 |
| 4.6.1 4.5-脱环氧纳他霉素的外排评估 | 第94-97页 |
| 4.6.2 只产生4,5-脱环氧纳他霉素的转运蛋白突变菌株构建 | 第97-98页 |
| 4.6.3 4,5-脱环氧纳他霉素转运途径研究 | 第98-100页 |
| 4.6.4 恰塔努加链霉菌对纳他霉素、4,5-脱环氧纳他霉素的耐受能力 | 第100-102页 |
| 4.6.5 4,5-脱环氧纳他霉素转运网络的调控应答机制 | 第102-103页 |
| 4.6.6 苷元-4,5-脱环氧纳他霉素转运机制初探 | 第103-105页 |
| 4.7 小结与讨论 | 第105-108页 |
| 第5章 研究成果与展望 | 第108-110页 |
| 5.1 本文研究成果 | 第108页 |
| 5.2 展望 | 第108-110页 |
| 附表 | 第110-113页 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114-116页 |
| 参考文献 | 第116-123页 |
