| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 中英文缩略词表 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一篇 文献综述 | 第14-22页 |
| 第一章 猪流行性腹泻(PED)概述 | 第14-18页 |
| 1 猪流行性腹泻的临床症状 | 第14页 |
| 2 流行病学分析 | 第14-15页 |
| 3 诊断与防制办法 | 第15-18页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒(PEDV)分子生物学特性 | 第18-22页 |
| 1 PEDV的病毒粒子结构 | 第18-19页 |
| 2 PEDV的基因组结构 | 第19页 |
| 3 S蛋白功能性分析及基于S基因序列的演化变异分析概述 | 第19-20页 |
| ·S蛋白功能性分析 | 第19页 |
| ·基于S基因序列的演化变异分析概述 | 第19-20页 |
| 4 PEDV的细胞培养特性 | 第20页 |
| 5 本研究的目的意义 | 第20-22页 |
| 第二篇 实验研究部分 | 第22-64页 |
| 第三章 PEDV野毒株的基因序列测定 | 第22-36页 |
| 摘要 | 第22-23页 |
| 1 实验材料 | 第23-24页 |
| ·临床病料来源 | 第23页 |
| ·临床样品采自杭州某猪场 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23页 |
| ·主要仪器 | 第23-24页 |
| 2 实验方法 | 第24-29页 |
| ·病料处理 | 第24页 |
| ·分段扩增S基因片段的引物设计与合成 | 第24页 |
| ·RT-PCR检测样品中PEDV | 第24-26页 |
| ·RNA提取方法 | 第24-25页 |
| ·反转录体系如下 | 第25页 |
| ·PCR反应体系与扩增条件 | 第25-26页 |
| ·RT-PCR产物的胶回收 | 第26-27页 |
| ·DNA测序及分析 | 第27-28页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·连接与转化 | 第27-28页 |
| ·S基因序列的测定与拼接 | 第28页 |
| ·应用DNAstar软件进行S基因序列的拼接 | 第28页 |
| ·基于S基因序列构建基因进化树并分析 | 第28-29页 |
| 3 实验结果 | 第29-34页 |
| ·猪肠粘膜匀浆液样品 | 第29-31页 |
| ·样品中PEDV检测结果 | 第29页 |
| ·PEDV S基因的分段扩增 | 第29-31页 |
| ·腹泻仔猪肛门棉拭子样品 | 第31页 |
| ·棉拭子样品中PEDV检测结果 | 第31页 |
| ·阳性产物S基因测序结果 | 第31页 |
| ·基于S基因全序列的演化变异分析 | 第31-34页 |
| ·S基因序列分析 | 第31-32页 |
| ·基于S基因序列的系统发育进化分析 | 第32-34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| ABSTRACT | 第35-36页 |
| 第四章 临床样品中PEDV的细胞分离培养 | 第36-50页 |
| 摘要 | 第36页 |
| 1 实验材料 | 第36-37页 |
| ·病毒与细胞 | 第36页 |
| ·主要试剂 | 第36-37页 |
| ·主要仪器和设备 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-41页 |
| ·病料处理 | 第37页 |
| ·Vero细胞的复苏 | 第37-38页 |
| ·细胞传代培养 | 第38页 |
| ·细胞的冻存方法 | 第38页 |
| ·Vero细胞对胰酶耐受性的测定 | 第38-39页 |
| ·原代病毒接种 | 第39页 |
| ·病毒冻存与收集 | 第39页 |
| ·病毒的增殖传代 | 第39页 |
| ·病毒增殖对胰酶依赖性的判定 | 第39页 |
| ·分离病毒的鉴定 | 第39-40页 |
| ·病毒RNA的提取及反转录成cDNA | 第39-40页 |
| ·RT-PCR鉴定 | 第40页 |
| ·RT-PCR产物的胶回收 | 第40页 |
| ·连接与转化 | 第40页 |
| ·质粒提取与鉴定 | 第40页 |
| ·空斑实验纯化病毒 | 第40-41页 |
| ·RT-PCR检测纯化后病毒 | 第41页 |
| 3 实验结果 | 第41-47页 |
| ·Vero细胞对胰酶的耐受性 | 第41页 |
| ·病毒的分离培养 | 第41-42页 |
| ·病毒增殖对胰酶依赖性的判定 | 第42-43页 |
| ·分离病毒的RT-PCR检测结果 | 第43-46页 |
| ·使用引物PEDV-S3检测分离的病毒 | 第43-44页 |
| ·引物PEDV-132/133检测分离病毒 | 第44-46页 |
| ·病毒空斑纯化实验 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| ABSTRACT | 第48-50页 |
| 第五章 PEDV反向遗传学操作系统的准备 | 第50-64页 |
| 摘要 | 第50页 |
| 1 实验材料 | 第50页 |
| ·细胞、病毒、质粒来源 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| 2 实验内容 | 第50-57页 |
| ·重组病毒mPEDV的增殖与鉴定 | 第50-52页 |
| ·重组病毒mPEDV简介 | 第50-51页 |
| ·mPEDV病毒传代增殖 | 第51页 |
| ·mPEDV的RT-PCR鉴定 | 第51-52页 |
| ·重组质粒的增殖与鉴定 | 第52-55页 |
| ·重组质粒简介 | 第52-53页 |
| ·质粒的克隆增殖 | 第53-54页 |
| ·质粒中提和浓度测定 | 第54-55页 |
| ·电击制备同源重组病毒 | 第55-57页 |
| ·RNA合成 | 第55-56页 |
| ·电击同源重组 | 第56-57页 |
| 3 实验结果 | 第57-61页 |
| ·mPEDV病毒的增殖与鉴定 | 第57-58页 |
| ·mPEDV的传代增殖 | 第57页 |
| ·mPEDV的RT-PCR鉴定结果 | 第57-58页 |
| ·质粒鉴定结果 | 第58-59页 |
| ·双酶切结果 | 第58页 |
| ·PCR鉴定结果 | 第58-59页 |
| ·电击转染制备同源重组病毒 | 第59-60页 |
| ·以质粒PEDVwt-DR13-dORF3/RLUC为模板合成RNA | 第59-60页 |
| ·重组病毒的增殖 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-62页 |
| ABSTRACT | 第62-64页 |
| 全文结论 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 附录 | 第70-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
