| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-8页 |
| 英文缩略表 | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-20页 |
| ·甲基对硫磷水解酶的研究进展 | 第9-15页 |
| ·有机磷农药概述 | 第9页 |
| ·甲基对硫磷水解酶概述 | 第9-10页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因 | 第10-11页 |
| ·甲基对硫磷水解酶蛋白结构的研究 | 第11-13页 |
| ·甲基对硫磷水解酶表达与分泌研究 | 第13-14页 |
| ·甲基对硫磷水解酶的分子改良 | 第14-15页 |
| ·甲基对硫磷水解酶的应用研究 | 第15页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展 | 第15-19页 |
| ·毕赤酵母的特点 | 第15-16页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的分泌途径 | 第16页 |
| ·提高外源蛋白在毕赤酵母分泌表达的策略 | 第16-19页 |
| ·研究目的与意义 | 第19-20页 |
| 第二章 热稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响 | 第20-45页 |
| ·引言 | 第20页 |
| ·实验材料 | 第20-22页 |
| ·菌株及质粒 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20页 |
| ·培养基及主要溶液的配制 | 第20-21页 |
| ·试验仪器 | 第21页 |
| ·引物 | 第21-22页 |
| ·试验方法 | 第22-34页 |
| ·甲基对硫磷水解酶pPIC9-mph表达载体的构建 | 第22-26页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因的获得 | 第22-23页 |
| ·DNA纯化回收 | 第23-24页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因与载体连接 | 第24页 |
| ·大肠杆菌Top10菌株热击感受态的制备 | 第24页 |
| ·热击转化Top10感受态细胞 | 第24-25页 |
| ·阳性菌株的鉴定 | 第25页 |
| ·pGM-T-mph和pPIC9质粒的提取 | 第25-26页 |
| ·载体pGM-T-mph和载体pPIC9的双酶切处理及连接 | 第26页 |
| ·甲基对硫磷水解酶突变体表达载体的构建 | 第26-28页 |
| ·热稳定性突变体pPIC9-S274Q-mph表达载体的构建 | 第26-28页 |
| ·其他甲基对硫磷水解酶突变体表达载体的构建 | 第28页 |
| ·电击转化毕赤酵母GS115 | 第28-29页 |
| ·质粒DNA线性化 | 第28-29页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态的制备 | 第29页 |
| ·电击转化毕赤酵母GS115 | 第29页 |
| ·甲基对硫磷水解酶酶活性测定方法的建立 | 第29-30页 |
| ·甲基对硫磷水解酶酶活性测定体系标准曲线的确立 | 第30页 |
| ·转化子筛选鉴定 | 第30-31页 |
| ·毕赤酵母阳性重组菌株小量培养 | 第31页 |
| ·毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养表达 | 第31页 |
| ·毕赤酵母热稳定性突变体重组菌株分泌途径基因转录水平分析 | 第31-34页 |
| ·酵母细胞壁的破碎 | 第31-32页 |
| ·RNA的提取 | 第32页 |
| ·RNA中基因组DNA的去除及验证 | 第32-33页 |
| ·RNA反转录第一链cDNA的获得 | 第33-34页 |
| ·第一链cDNA的验证 | 第34页 |
| ·RT-PCR | 第34页 |
| ·结果与分析 | 第34-43页 |
| ·甲基对硫磷水解酶pPIC9-mph表达载体的构建 | 第34-35页 |
| ·热稳定性突变体pPIC9-S274Q-mph表达载体的构建 | 第35页 |
| ·电击转化毕赤酵母GS115 | 第35-36页 |
| ·甲基对硫磷水解酶酶活性测定体系标准曲线的确立 | 第36-37页 |
| ·毕赤酵母阳性重组菌株小量培养 | 第37-39页 |
| ·毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养表达 | 第39-41页 |
| ·毕赤酵母重组菌株生长曲线测定 | 第39页 |
| ·毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养酶活性测定及SDS-PAGE分析 | 第39-41页 |
| ·毕赤酵母热稳定性突变体重组菌株分泌途径基因转录水平分析 | 第41-43页 |
| ·讨论 | 第43-45页 |
| 第三章 酸稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响 | 第45-51页 |
| ·引言 | 第45页 |
| ·实验材料 | 第45页 |
| ·试验方法 | 第45-46页 |
| ·甲基对硫磷水解酶突变体表达载体的构建 | 第45页 |
| ·毕赤酵母阳性重组菌株小量培养 | 第45-46页 |
| ·毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养表达 | 第46页 |
| ·毕赤酵母酸稳定性突变体重组菌株分泌途径基因转录水平分析 | 第46页 |
| ·结果与分析 | 第46-50页 |
| ·毕赤酵母阳性重组菌株小量培养 | 第46-48页 |
| ·毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养表达及SDS-PAGE分析 | 第48-49页 |
| ·毕赤酵母酸稳定性突变体重组菌株分泌途径基因转录水平分析 | 第49-50页 |
| ·讨论 | 第50-51页 |
| 第四章 甲基对硫磷水解酶与融合标签eGFP的共表达 | 第51-55页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·实验材料 | 第51页 |
| ·试验方法 | 第51-53页 |
| ·pPIC9r-mph-刚-e GFP的构建 | 第51-53页 |
| ·其他融合表达载体质粒的构建 | 第53页 |
| ·毕赤酵母重组菌株阳性菌株筛选 | 第53页 |
| ·毕赤酵母重组菌株阳性菌株荧光强度的观察 | 第53页 |
| ·结果与分析 | 第53-54页 |
| ·讨论 | 第54-55页 |
| 第五章 全文结论 | 第55-57页 |
| ·结论 | 第55-56页 |
| ·后续工作 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 致谢 | 第62-64页 |
| 作者简介 | 第64-65页 |
