| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 符号说明 | 第10-15页 |
| 第一章 研究综述 | 第15-33页 |
| 1 鱼类无乳链球菌病的研究进展 | 第15-24页 |
| ·病原学 | 第15-16页 |
| ·流行病学 | 第16-17页 |
| ·症状和病理变化 | 第17页 |
| ·主要毒力因子 | 第17-22页 |
| ·防控 | 第22-24页 |
| 2 鱼类基因工程疫苗的研究进展 | 第24-31页 |
| ·重组亚单位疫苗 | 第25-27页 |
| ·核酸疫苗 | 第27-29页 |
| ·基因缺失疫苗 | 第29-30页 |
| ·活载体疫苗 | 第30页 |
| ·我国水产基因工程疫苗面临的挑战 | 第30-31页 |
| 3 研究目的与意义 | 第31-33页 |
| 第二章 鱼源无乳链球菌bca基因的克隆、鉴定与生物信息学分析 | 第33-49页 |
| 1 试验材料 | 第33-35页 |
| ·菌株 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33-34页 |
| ·主要试剂 | 第34-35页 |
| ·主要试剂配置 | 第35页 |
| 2 试验方法 | 第35-37页 |
| ·引物设计与合成 | 第35-36页 |
| ·菌株培养及DNA制备 | 第36页 |
| ·bca基因的PCR扩增 | 第36-37页 |
| ·bca基因的T克隆、测序及序列分析 | 第37页 |
| ·bca基因的生物信息学分析 | 第37页 |
| 3 结果 | 第37-47页 |
| ·bca基因的扩增、测序及核苷酸序列特征分析 | 第37-39页 |
| ·蛋白质序列特征分析 | 第39-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 5 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 无乳链球菌pbca基因重组表达质粒的构建及免疫原性分析 | 第49-67页 |
| 1 试验材料 | 第49-53页 |
| ·质粒、菌株和细胞 | 第49-50页 |
| ·试验动物 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50-51页 |
| ·主要溶液及培养基的配置 | 第51-53页 |
| 2 试验方法 | 第53-60页 |
| ·引物设计 | 第53页 |
| ·pbca基因的PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·pbca纯化PCR产物与pMD19-T连接 | 第54-55页 |
| ·DH5α感受态细胞的转化 | 第55页 |
| ·pMD19-T-pbca重组质粒的鉴定 | 第55-56页 |
| ·原核表达载体pET-32a(+)-pbca基因的构建和表达 | 第56-58页 |
| ·pBCA蛋白的制备与纯化 | 第58页 |
| ·兔抗pBCA蛋白抗体的制备 | 第58-60页 |
| 3 结果 | 第60-64页 |
| ·无乳链球菌pbca基因的PCR扩增、T克隆及表达载体的构建 | 第60-62页 |
| ·重组质粒pET-32a(+)-pbca诱导表达、表达条件优化及纯化 | 第62页 |
| ·兔抗IgG的制备及效价测定 | 第62-63页 |
| ·Western-blot检测兔抗重组pBCA抗体的免疫原性 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| ·表达区间的选择 | 第64页 |
| ·表达宿主菌的选择 | 第64-65页 |
| ·表达载体的选择 | 第65-66页 |
| ·重组蛋白免疫原性的分析 | 第66页 |
| 5 小结 | 第66-67页 |
| 第四章 无乳链球菌pbca基因重组亚单位疫苗对罗非鱼免疫效果的研究 | 第67-84页 |
| 1 试验材料 | 第67-68页 |
| ·试验菌株 | 第67页 |
| ·试验动物 | 第67-68页 |
| ·主要仪器 | 第68页 |
| ·主要试剂 | 第68页 |
| ·主要试剂配置 | 第68页 |
| 2 试验方法 | 第68-74页 |
| ·免疫抗原制备 | 第68-69页 |
| ·试验鱼的安全性 | 第69页 |
| ·疫苗的安全性试验 | 第69页 |
| ·免疫试验鱼 | 第69页 |
| ·采血 | 第69页 |
| ·ELISA检测抗体水平 | 第69-70页 |
| ·溶菌酶检测 | 第70页 |
| ·攻毒试验 | 第70-71页 |
| ·免疫基因的检测 | 第71-73页 |
| ·统计学分析 | 第73-74页 |
| 3 试验结果 | 第74-79页 |
| ·试验罗非鱼健康试验 | 第74页 |
| ·疫苗对罗非鱼的安全性试验 | 第74-75页 |
| ·罗非鱼抗pBCA抗体水平检测 | 第75页 |
| ·免疫保护率 | 第75-76页 |
| ·攻毒后罗非鱼症状与细菌鉴定 | 第76-77页 |
| ·溶菌酶检测 | 第77-78页 |
| ·IL-1β和TNF-α基因检测 | 第78-79页 |
| 4 讨论 | 第79-83页 |
| ·pBCA亚单位疫苗的构建 | 第79-80页 |
| ·疫苗免疫效果评价 | 第80-81页 |
| ·IL-1β和TNF-α基因转录水平的变化 | 第81-82页 |
| ·免疫方式和免疫次数 | 第82页 |
| ·免疫佐剂的选择 | 第82-83页 |
| 5 小结 | 第83-84页 |
| 第五章 无乳链球菌pbca基因核酸疫苗的构建 | 第84-91页 |
| 1 试验材料 | 第84-85页 |
| ·试验菌株 | 第84-85页 |
| ·主要仪器 | 第85页 |
| ·主要试剂 | 第85页 |
| 2 试验方法 | 第85-88页 |
| ·引物设计 | 第85-86页 |
| ·pbca基因的PCR扩增 | 第86页 |
| ·pbca纯化PCR产物与pMD19-T连接 | 第86页 |
| ·转化至DH5a | 第86页 |
| ·pcDNA3.1(+)-pbca重组质粒的鉴定 | 第86页 |
| ·真核重组质粒pcDNA3.1(+)-pbca的构建和表达 | 第86-88页 |
| 3 试验结果 | 第88-90页 |
| ·重组质粒pcDNA3.1(+)-pbca的构建 | 第88-89页 |
| ·质粒浓度和纯度检测 | 第89-90页 |
| 4 讨论 | 第90页 |
| ·表达基因的选择 | 第90页 |
| ·表达质粒的选择 | 第90页 |
| 5 小结 | 第90-91页 |
| 第六章 无乳链球菌pbca基因核酸疫苗对罗非鱼免疫效果的研究 | 第91-103页 |
| 1 试验材料 | 第91-92页 |
| ·试验菌株 | 第91页 |
| ·试验动物 | 第91页 |
| ·主要仪器 | 第91-92页 |
| ·主要试剂 | 第92页 |
| ·主要试剂配置 | 第92页 |
| 2 试验方法 | 第92-95页 |
| ·免疫试验鱼 | 第92-93页 |
| ·采血 | 第93页 |
| ·真核重组质粒在罗非鱼上的表达 | 第93页 |
| ·ELISA检测抗体水平 | 第93-94页 |
| ·溶菌酶检测 | 第94页 |
| ·疫苗的安全性试验 | 第94页 |
| ·攻毒试验 | 第94-95页 |
| ·免疫基因的检测 | 第95页 |
| ·统计学分析 | 第95页 |
| 3 试验结果 | 第95-100页 |
| ·疫苗的安全性 | 第95-96页 |
| ·罗非鱼核酸疫苗抗体水平检测 | 第96-97页 |
| ·免疫保护率 | 第97页 |
| ·溶菌酶检测 | 第97-98页 |
| ·目的基因在体内的转录 | 第98-99页 |
| ·IL-1β和TNF-α基因的检测 | 第99-100页 |
| 4 讨论 | 第100-102页 |
| ·鱼类DNA疫苗的接种方式及剂量 | 第100-101页 |
| ·DNA疫苗的效果 | 第101-102页 |
| 5 小结 | 第102-103页 |
| 第七章 结论与创新点 | 第103-105页 |
| 1 结论 | 第103-104页 |
| 2 创新点 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-114页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第114-115页 |
| 致谢 | 第115页 |
