| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-19页 |
| 第一章 脑心肌炎研究进展 | 第19-39页 |
| 1 EMCV的生物学特性 | 第19-21页 |
| 2 流行病学 | 第21-22页 |
| 3 致病机理 | 第22-23页 |
| ·EMCV致病分子基础 | 第22页 |
| ·机体损伤及免疫应答 | 第22-23页 |
| 4 EMCV诊断技术 | 第23-26页 |
| ·抗原检测 | 第24-25页 |
| ·病毒抗体检测 | 第25-26页 |
| 5 疫苗 | 第26-28页 |
| ·常规疫苗 | 第26-27页 |
| ·基因工程疫苗 | 第27-28页 |
| 6 防控 | 第28-29页 |
| 参考文献 | 第29-39页 |
| 第二章 RNA干扰技术研究进展 | 第39-61页 |
| 1 RNAi的发生机制 | 第39-41页 |
| 2 RNAi技术主要特征 | 第41-42页 |
| 3 RNA干扰实验技术 | 第42-43页 |
| ·RNAi分子设计 | 第42-43页 |
| ·siRNA实施手段 | 第43页 |
| 4 介导RNAi的病毒载体 | 第43-46页 |
| ·逆转录病毒载体 | 第44页 |
| ·腺病毒载体 | 第44-45页 |
| ·慢病毒载体 | 第45页 |
| ·腺相关病毒载体 | 第45-46页 |
| ·杆状病毒载体 | 第46页 |
| 5 RNAi抗病毒应用 | 第46-50页 |
| 6 RNAi技术前景 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-61页 |
| 第三章 猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定 | 第61-81页 |
| 摘要 | 第61-62页 |
| 1 材料与方法 | 第62-68页 |
| ·病料来源 | 第62页 |
| ·细胞与抗体 | 第62页 |
| ·其它主要试剂 | 第62页 |
| ·病毒分离 | 第62页 |
| ·TCID_(50)测定 | 第62页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第62-63页 |
| ·EMCV VP1基因RT-PCR与序列分析 | 第63-65页 |
| ·病毒浓缩纯化与电镜观察 | 第65-66页 |
| ·病毒对不同细胞系易感性 | 第66页 |
| ·病毒耐热性试验 | 第66页 |
| ·小鼠攻毒试验 | 第66页 |
| ·仔猪攻毒试验 | 第66-67页 |
| ·组织病理学观察 | 第67页 |
| ·免疫组织化学试验 | 第67-68页 |
| ·血清中和抗体检测 | 第68页 |
| 2 结果 | 第68-75页 |
| ·病毒分离培养 | 第68-69页 |
| ·间接免疫荧光试验 | 第69-70页 |
| ·EMCV VP1基因RT-PCR扩增和序列分析 | 第70-71页 |
| ·电镜观察 | 第71页 |
| ·病毒对其它细胞系的易感性 | 第71-72页 |
| ·病毒耐热性 | 第72页 |
| ·小鼠人工感染试验 | 第72-74页 |
| ·仔猪人工感染试验 | 第74-75页 |
| 3 讨论 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| ABSTRACT | 第79-81页 |
| 第四章 猪脑心肌炎病毒NJ08分离株全基因组序列测定与分析 | 第81-99页 |
| 摘要 | 第81-82页 |
| 1 材料与方法 | 第82-91页 |
| ·细胞和病毒 | 第82页 |
| ·主要试剂 | 第82页 |
| ·引物设计 | 第82-84页 |
| ·RNA的提取 | 第84页 |
| ·片段F1-F5的RT-PCR扩增 | 第84页 |
| ·EMCV NJ08株基因组5’末端的扩增 | 第84-87页 |
| ·EMCV NJ08株基因组3’末端的扩增 | 第87-88页 |
| ·片断F1-F5、5'末端和3’末端PCR产物的克隆与鉴定 | 第88-89页 |
| ·同源性比较 | 第89-90页 |
| ·系统进化分析 | 第90-91页 |
| 2 结果 | 第91-93页 |
| ·病毒基因组分段扩增与测序 | 第91页 |
| ·基因组组成和结构 | 第91-92页 |
| ·核苷酸和推导的氨基酸比较 | 第92-93页 |
| ·基因进化树分析 | 第93页 |
| 3 讨论 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-97页 |
| ABSTRACT | 第97-99页 |
| 第五章 脑心肌炎病毒SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 | 第99-113页 |
| 摘要 | 第99-100页 |
| 1 材料与方法 | 第100-102页 |
| ·病毒与样品 | 第100页 |
| ·主要试剂 | 第100页 |
| ·引物的设计与合成 | 第100页 |
| ·RNA提取 | 第100-101页 |
| ·cDNA合成 | 第101页 |
| ·实时PCR | 第101页 |
| ·特异性 | 第101-102页 |
| ·敏感性 | 第102页 |
| ·重复性 | 第102页 |
| ·相对定量方法 | 第102页 |
| ·数据分析 | 第102页 |
| 2 结果 | 第102-108页 |
| ·实时PCR反应条件及体系的优化 | 第102-104页 |
| ·实时PCR特异性 | 第104-105页 |
| ·实时PCR敏感性 | 第105-106页 |
| ·实时PCR重复性 | 第106-107页 |
| ·本方法与普通RT-PCR比较 | 第107-108页 |
| 3 讨论 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-111页 |
| ABSTRACT | 第111-113页 |
| 第六章 靶向EMCV 1D和3AB基因shRNA重组质粒构建及其体内外抑制EMCV复制作用 | 第113-137页 |
| 摘要 | 第113-114页 |
| 1 材料与方法 | 第114-123页 |
| ·细胞、病毒及质粒 | 第114页 |
| ·主要试剂 | 第114-115页 |
| ·siRNA设计 | 第115-116页 |
| ·shRNA表达质粒构建与鉴定 | 第116-117页 |
| ·1D-EGFP、3AB-EGFP融合表达质粒的构建与鉴定 | 第117-119页 |
| ·EMCV 1D、3AB与EGFP基因融合表达 | 第119-120页 |
| ·shRNA表达质粒体外抑制EMCV复制实验 | 第120页 |
| ·shRNA抑制1D、3AB蛋白表达实验 | 第120页 |
| ·病毒滴度测定 | 第120-121页 |
| ·间接免疫荧光实验(IFA) | 第121页 |
| ·实时PCR检测BHK-21细胞及小鼠脑组织中EMCV含量 | 第121页 |
| ·实时PCR | 第121页 |
| ·shRNA表达质粒体内抑制EMCV复制 | 第121-123页 |
| ·统计分析 | 第123页 |
| 2 结果 | 第123-131页 |
| ·shRNA表达质粒的构建与鉴定 | 第123-124页 |
| ·重组质粒ORFs-EGFP融合蛋白表达鉴定 | 第124页 |
| ·shRNA抑制EMCV细胞病变 | 第124-125页 |
| ·shRNA抑制EMCV在BHK-21细胞中复制 | 第125-126页 |
| ·shRNA抑制EMCV靶基因在HEK-293A细胞中表达 | 第126-127页 |
| ·shRNA减轻小鼠EMCV攻毒临床症状和病理变化 | 第127-130页 |
| ·shRNA抑制小鼠脑组织EMCV含量 | 第130-131页 |
| 3 讨论 | 第131-133页 |
| 参考文献 | 第133-136页 |
| ABSTRACT | 第136-137页 |
| 第七章 靶向脑心肌炎病毒1D和3AB基因shRNA重组腺病毒的构建与鉴定 | 第137-153页 |
| 摘要 | 第137-138页 |
| 1 材料与方法 | 第138-145页 |
| ·质粒、菌株、病毒与细胞 | 第138页 |
| ·主要试剂 | 第138页 |
| ·引物设计与PCR扩增 | 第138-139页 |
| ·目的基因回收与纯化 | 第139页 |
| ·重组穿梭载体pAdTrack-CMV的构建 | 第139-141页 |
| ·重组穿梭载体与腺病毒骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组 | 第141-143页 |
| ·重组腺病毒的获得 | 第143-145页 |
| 2 结果 | 第145-148页 |
| ·P_(H1)-shRNA表达框扩增与腺病毒穿梭载体构建 | 第145-147页 |
| ·腺病毒重组质粒构建与鉴定 | 第147页 |
| ·重组腺病毒收获及其滴度测定 | 第147-148页 |
| ·重组腺病毒基因组中PH_(H1)-shRNA表达框的PCR鉴定 | 第148页 |
| 3 讨论 | 第148-150页 |
| 参考文献 | 第150-152页 |
| ABSTRACT | 第152-153页 |
| 第八章 腺病毒介导的靶向EMCV 1D和3AB基因shRNA体内外抑制EMCV复制作用 | 第153-173页 |
| 摘要 | 第153-154页 |
| 1 材料与方法 | 第154-157页 |
| ·病毒及细胞 | 第154页 |
| ·主要试剂 | 第154页 |
| ·病毒滴度测定 | 第154页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第154-155页 |
| ·流式细胞分析(FACS) | 第155页 |
| ·Western blot | 第155页 |
| ·实时PCR | 第155-156页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV在MARC-145细胞上的复制 | 第156页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV复制效果的持续性研究 | 第156页 |
| ·重组腺病毒对EMCV复制抑制作用的剂量依赖性 | 第156页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV在小鼠体内复制的效果评价 | 第156-157页 |
| ·统计分析 | 第157页 |
| 2 结果 | 第157-166页 |
| ·重组腺病毒感染细胞剂量与培养时间选择 | 第157页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV在MARC-145细胞复制 | 第157-158页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV靶基因转录 | 第158-159页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV靶基因蛋白表达 | 第159-160页 |
| ·重组腺病毒抑制EMCV复制作用的持续性和剂量依赖性 | 第160-161页 |
| ·重组腺病毒抑制预先感染EMCV的复制作用 | 第161-162页 |
| ·重组腺病毒抑制小鼠EMCV复制 | 第162-166页 |
| 3 讨论 | 第166-168页 |
| 参考文献 | 第168-171页 |
| ABSTRACT | 第171-173页 |
| 全文总结 | 第173-175页 |
| 攻读学位期间发表或完成论文 | 第175-177页 |
| 致谢 | 第177页 |
