| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 1 引言 | 第15-34页 |
| ·纤维素的研究概况 | 第15-17页 |
| ·纤维素的化学组成及结构 | 第15-16页 |
| ·纤维素的降解 | 第16-17页 |
| ·纤维素酶研究进展 | 第17-24页 |
| ·纤维素酶系的组成 | 第17-18页 |
| ·纤维素酶的催化机制 | 第18页 |
| ·纤维素酶的结构和功能 | 第18-22页 |
| ·纤维素酶基因的克隆 | 第22页 |
| ·纤维素酶基因的表达 | 第22-23页 |
| ·纤维素的应用 | 第23-24页 |
| ·纤维素酶在食品业的应用 | 第23页 |
| ·纤维素酶在酿造发酵工业上的应用 | 第23-24页 |
| ·纤维素酶在饲料业上的应用 | 第24页 |
| ·纤维素酶在能源和环境保护上的应用 | 第24页 |
| ·酶的定向进化 | 第24-28页 |
| ·定向进化中构建突变文库的方法 | 第25-26页 |
| ·易错 PCR | 第25页 |
| ·随机引物体外重组（Random-priming in vitro recombination RPR) | 第25页 |
| ·DNA 改组（DNA shuffling） | 第25-26页 |
| ·交错延伸重组（Stagger extension process StEP） | 第26页 |
| ·定向进化中突变文库筛选的方法 | 第26-28页 |
| ·突变体的分离 | 第27页 |
| ·琼脂板涂布法 | 第27页 |
| ·微孔板悬浮法 | 第27-28页 |
| ·通过酶促反应的特征 | 第28页 |
| ·加入底物染色 | 第28页 |
| ·分光光度计和荧光酶标仪检测 | 第28页 |
| ·分子改造的应用 | 第28-30页 |
| ·改变酶特异性 | 第29页 |
| ·稳定性和表达能力的改变 | 第29页 |
| ·新的特异性和活性 | 第29-30页 |
| ·纤维素酶的定向进化 | 第30-32页 |
| ·选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第32-34页 |
| ·选题的目的意义 | 第32页 |
| ·研究内容 | 第32-33页 |
| ·技术路线 | 第33-34页 |
| 2 材料和方法 | 第34-53页 |
| ·材料 | 第34-37页 |
| ·供试菌株 | 第34页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·酶和生化试剂 | 第34页 |
| ·仪器 | 第34页 |
| ·溶液配制 | 第34-36页 |
| ·培养基 | 第36-37页 |
| ·基因克隆 | 第37-41页 |
| ·eg1 基因的 PCR 扩增 | 第37-38页 |
| ·PCR 产物回收 | 第38-39页 |
| ·回收产物与载体连接 | 第39页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第39页 |
| ·重组质粒的筛选、鉴定及质粒 DNA 的提取 | 第39-41页 |
| ·菌落 PCR 检测 | 第39-40页 |
| ·质粒 DNA 的提取 | 第40-41页 |
| ·序列测定 | 第41页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 和糖苷水解酶 61f 在毕赤酵母中的高效表达及性质研究 | 第41-48页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 酵母表达载体的构建 | 第41-43页 |
| ·线性化酶切和去磷酸化 | 第43页 |
| ·酵母转化 | 第43-44页 |
| ·毕赤酵母 GS115 感受态的制备 | 第43-44页 |
| ·重组质粒 pPIC9K/eg1 电击转化感受态酵母 GS115 细胞 | 第44页 |
| ·酵母转化子的筛选 | 第44-45页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第44页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第44-45页 |
| ·酵母转化子的 PCR 鉴定 | 第45-46页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 和糖苷水解酶 61f 的诱导分泌表达 | 第46页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 的诱导分泌表达 | 第46页 |
| ·糖苷水解酶 61f 的诱导分泌表达 | 第46页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 和糖苷水解酶 61f 工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第46-48页 |
| ·发酵液的制备 | 第46页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第46页 |
| ·DEAE-SepHarose 阴离子交换柱层析 | 第46-47页 |
| ·纯化产物活性测定 | 第47页 |
| ·纯化产物 SDS-PAGE 分析 | 第47页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第47页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 工程菌 N24 的酶学性质 | 第47-48页 |
| ·糖苷水解酶 61F 的酶学性质及对内切葡聚糖酶 N24 的作用 | 第48页 |
| ·嗜热真菌内切纤维素酶 eg1 的定向进化 | 第48-53页 |
| ·易错 PCR | 第48-49页 |
| ·易错 PCR 产物回收 | 第49页 |
| ·易错 PCR 产物双酶切和纯化 | 第49页 |
| ·易错 PCR 产物双酶切 | 第49页 |
| ·易错 PCR 酶切产物纯化 | 第49页 |
| ·表达载体 pPIC9K 的酶切和纯化 | 第49页 |
| ·表达载体 pPIC9K 的双酶切 | 第49页 |
| ·表达载体 pPIC9K 酶切产物纯化 | 第49页 |
| ·突变体库的构建 | 第49-50页 |
| ·易错 PCR 产物与载体 pPIC9K 的连接 | 第49-50页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 DH5α | 第50页 |
| ·重组质粒的提取 | 第50页 |
| ·重组质粒的线性化和脱磷酸化 | 第50页 |
| ·酵母转化 | 第50页 |
| ·突变体库的筛选方法 | 第50-51页 |
| ·正向突变体的底物平板筛选 | 第50-51页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第51页 |
| ·正向突变体的小量发酵 | 第51页 |
| ·突变基因序列测定 | 第51页 |
| ·大量发酵确定突变体 | 第51页 |
| ·突变内切葡聚糖酶 teg1 工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第51-53页 |
| ·突变内切葡聚糖酶 teg1 工程菌表达产物的纯化 | 第51-52页 |
| ·突变内切葡聚糖酶 teg1 工程菌表达产物的酶学性质 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-74页 |
| ·eg1 基因成熟蛋白编码序列的克隆 | 第53-54页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶 eg1 基因序列测定与分析 | 第54-55页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶 eg1 基因序列测定 | 第54-55页 |
| ·内切葡聚糖酶基因 eg1 的核苷酸序列分析 | 第55页 |
| ·内切葡聚糖酶基因 eg1 的氨基酸序列分析 | 第55页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 在毕赤酵母中的高效表达 | 第55-57页 |
| ·毕赤酵母的电击转化和重组菌株的鉴定 | 第57-58页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第57页 |
| ·eg1 基因多拷贝整合子的筛选 | 第57-58页 |
| ·酵母转化子的 PCR 鉴定 | 第58页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 和糖苷水解酶 61f 的诱导分泌表达及表达产物的检测 | 第58-60页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 基因在 P. pastoris 中的诱导高效表达、高表达酵母菌株的筛选和表达产物的分析 | 第58-59页 |
| ·糖苷水解酶 61F 在 P. pastoris 中的诱导高效表达和基因表达产物的分析 | 第59-60页 |
| ·表达内切葡聚糖酶和 61F 糖苷水解酶的纯化及酶学性质 | 第60-66页 |
| ·表达内切葡聚糖酶的纯化 | 第60页 |
| ·61F 糖苷水解酶的纯化 | 第60-61页 |
| ·表达内切葡聚糖酶 eg1 的酶学性质测定 | 第61-63页 |
| ·表达内切葡聚糖酶 eg1 的最适反应温度 | 第61-62页 |
| ·表达内切葡聚糖酶的最适 pH | 第62页 |
| ·表达内切葡聚糖酶不同底物的酶活力测定 | 第62-63页 |
| ·表达内切葡聚糖酶的热稳定性 | 第63页 |
| ·61F 糖苷水解酶的酶学性质研究及对内切葡聚糖酶 N24 的作用 | 第63-66页 |
| ·61F 糖苷水解酶的最适温度 | 第63-64页 |
| ·61F 糖苷水解酶的最适 pH | 第64页 |
| ·61 糖苷水解酶的最适底物 | 第64页 |
| ·61F 糖苷水解酶的热稳定性 | 第64-65页 |
| ·不同金属离子对糖苷水解酶 61F 维素酶活性的影响 | 第65页 |
| ·糖苷水解酶 61F 内切葡聚糖酶 N24 活性的促进作用 | 第65-66页 |
| ·不同金属离子对混合酶活性的影响 | 第66页 |
| ·嗜热真菌内切纤维素酶 eg1 的定向进化 | 第66-74页 |
| ·易错 PCR | 第66-67页 |
| ·突变基因的筛选 | 第67-68页 |
| ·刚果红底物平板初筛 | 第67-68页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第68页 |
| ·小量发酵筛选 | 第68页 |
| ·大量发酵筛选 | 第68页 |
| ·突变体 NT0251 蛋白的纯化 | 第68-70页 |
| ·DEAE-SepHarose 阴离子交换柱层析 | 第68-69页 |
| ·NT0251 突变体 SDS-PAGE | 第69-70页 |
| ·突变体 NT0251 的酶学性质 | 第70-72页 |
| ·NT0251 的最适温度 | 第70页 |
| ·NT0251 的最适 pH | 第70-71页 |
| ·NT0251 的最适底物 | 第71页 |
| ·NT0251 的热稳定性 | 第71-72页 |
| ·突变体 NT0251 的序列测定 | 第72-74页 |
| 4 讨论 | 第74-77页 |
| ·纤维素酶基因的克隆与表达 | 第74页 |
| ·突变体库的构建 | 第74-75页 |
| ·突变体的筛选 | 第75-76页 |
| ·突变体活性提高的机制 | 第76-77页 |
| 5 结论和建议 | 第77-79页 |
| ·结论 | 第77页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 和葡萄糖苷酶 61f 基因的表达和性质研究 | 第77页 |
| ·内切葡聚糖酶 eg1 基因的定向进化 | 第77页 |
| ·建议 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 | 第87页 |
