| 摘要 | 第1-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第16-27页 |
| ·蛋白质药物的特点 | 第16页 |
| ·自杀基因治疗的癌症治疗 | 第16-17页 |
| ·胞嘧啶脱氨酶 | 第17-20页 |
| ·原核胞嘧啶脱氨酶的结构 | 第18-19页 |
| ·原核胞嘧啶脱氨酶的酶学性质及突变 | 第19-20页 |
| ·以穿膜肽介导胞嘧啶脱氨酶的肿瘤治疗 | 第20-26页 |
| ·细胞穿膜肽的研究历史 | 第20-21页 |
| ·细胞穿膜肽的的分类 | 第21-26页 |
| ·多聚精氨酸融合蛋白表达载体的构建 | 第26页 |
| ·本研究目的与意义 | 第26-27页 |
| 2 材料 | 第27-30页 |
| ·细胞株及菌株 | 第27页 |
| ·主要试剂 | 第27页 |
| ·实验动物 | 第27页 |
| ·主要仪器和设备 | 第27-28页 |
| ·引物合成 | 第28-30页 |
| 3 方法 | 第30-47页 |
| ·重组质粒 PSUMO-EGFP 的构建 | 第30-34页 |
| ·EGFP 基因的克隆 | 第30页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第30-31页 |
| ·PCR 回收产物与克隆载体的连接 | 第31页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31页 |
| ·重组克隆质粒的转化 | 第31页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第31-32页 |
| ·阳性重组质粒的鉴定 | 第32-33页 |
| ·EGFP 序列测定与结果分析 | 第33页 |
| ·EGFP 基因与载体 pSUMO 的制备 | 第33页 |
| ·EGFP 基因与 pSUMO 表达载体的连接 | 第33-34页 |
| ·重组原核表达载体的转化 | 第34页 |
| ·阳性重组质粒的筛选与鉴定 | 第34页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-EGFP 的构建 | 第34-36页 |
| ·EGFP 基因的克隆 | 第34-35页 |
| ·R9 序列及 GSlinker 序列的制备 | 第35页 |
| ·重组质粒 pSUMO-R9-EGFP 的制备 | 第35-36页 |
| ·重组质粒 PSUMO-CD 的构建 | 第36-37页 |
| ·CD 基因的克隆 | 第36-37页 |
| ·重组质粒 pSUMO-CD 的制备 | 第37页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-CD 的构建 | 第37-38页 |
| ·CD 基因的克隆 | 第37页 |
| ·重组质粒 pSUMO-R9-CD 的制备 | 第37-38页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-CDMUT 的构建 | 第38-40页 |
| ·CDmut 基因前半段的克隆 | 第38页 |
| ·CDmut 基因后半段的克隆 | 第38-39页 |
| ·重组质粒 pSUMO-R9-CDmut 的制备 | 第39-40页 |
| ·重组质粒 PSUMO-FLAG-CD、PSUMO-FLAG-R9-CD、PSUMO-R9-FLAG-CD 的构建 | 第40-41页 |
| ·重组质粒 pSUMO-FLAG-CD 的制备 | 第40页 |
| ·重组质粒 pSUMO-FLAG-R9-CD 的制备 | 第40-41页 |
| ·重组质粒 pSUMO-R9-FLAG-CD 的制备 | 第41页 |
| ·重组质粒的表达 | 第41-42页 |
| ·阳性重组质粒转化表达宿主菌及鉴定 | 第41页 |
| ·重组质粒的诱导 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE 分析目的基因表达产物 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第42页 |
| ·SUMO 融合蛋白的纯化 | 第42页 |
| ·SUMO 融合蛋白的酶切与纯化 | 第42页 |
| ·R9-EGFP 穿膜活性的检测 | 第42-43页 |
| ·HepG2 细胞、U251 细胞的培养 | 第42-43页 |
| ·R9-EGFP 穿膜活性的流式细胞仪检测 | 第43页 |
| ·R9-EGFP 穿膜活性的激光共聚焦观测 | 第43页 |
| ·肝素对 R9-EGFP 穿膜效率的抑制试验 | 第43页 |
| ·R9-CD 穿膜活性的检测 | 第43-44页 |
| ·Western blot 检测 FLAG 标签的特异性 | 第43-44页 |
| ·Western blot 检测 R9-CD 的穿膜活性 | 第44页 |
| ·MTT 比色法检测重组 R9-CD、R9-CDMUT 的生物活性 | 第44-45页 |
| ·建立 H22 小鼠肝癌模型并检测 R9-CD、R9-CDMUT 的体内内活性 | 第45-47页 |
| ·动物模型的建立 | 第45页 |
| ·实验动物分组及给药 | 第45页 |
| ·实验动物处理 | 第45-46页 |
| ·病理形态学观察 | 第46-47页 |
| 4 实验结果 | 第47-73页 |
| ·重组质粒 PSUMO-EGFP 的构建 | 第47-49页 |
| ·EGFP 基因的克隆 | 第47-48页 |
| ·pSUMO-EGFP 表达载体的构建 | 第48-49页 |
| ·重组质粒 PSUMO-EGFP 在大肠杆菌中表达 | 第49页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-EGFP 的构建 | 第49-51页 |
| ·EGFP 基因的克隆 | 第49-50页 |
| ·pSUMO-R9-EGFP 表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-EGFP 在大肠杆菌中表达 | 第51页 |
| ·EGFP 与 R9-EGFP 目的蛋白的纯化 | 第51-53页 |
| ·SUMO-EGFP 与 SUMO-R9-EGFP 融合蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| ·SUMO 融合蛋白的脱盐与酶切 | 第52页 |
| ·EGFP 与 R9-EGFP 成熟蛋白的纯化 | 第52-53页 |
| ·R9-EGFP 穿膜能力的检测 | 第53-57页 |
| ·R9-EGFP 穿膜能力的时间依赖性检测 | 第53-54页 |
| ·R9-EGFP 穿膜能力的剂量依赖性检测 | 第54-55页 |
| ·R9-EGFP 穿膜能力的激光共聚焦检测 | 第55-56页 |
| ·肝素对 R9-EGFP 穿膜活性的抑制结果 | 第56-57页 |
| ·重组质粒 PSUMO-CD 的构建 | 第57-58页 |
| ·CD 基因的克隆 | 第57-58页 |
| ·pSUMO-CD 表达载体的构建 | 第58页 |
| ·重组质粒 PSUMO-CD 在大肠杆菌中表达 | 第58-59页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-CD 的构建 | 第59-60页 |
| ·CD 基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·pSUMO-R9-CD 表达载体的构建 | 第60页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-CD 在大肠杆菌中表达 | 第60-61页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-CDMUT 的构建 | 第61-63页 |
| ·CDmut 基因的克隆 | 第61-62页 |
| ·pSUMO-R9-CDmut 表达载体的构建 | 第62-63页 |
| ·重组质粒 PSUMO-R9-CDMUT 在大肠杆菌中表达 | 第63-64页 |
| ·CD、R9-CD 与 R9-CDMUT 目的蛋白的纯化 | 第64-66页 |
| ·SUMO-CD、SUMO-R9-CD 与 SUMO-R9-CDmut 融合蛋白的纯化 | 第64-65页 |
| ·SUMO 融合蛋白的脱盐与酶切 | 第65页 |
| ·CD、R9-CD 与 R9-CDmut 成熟蛋白的纯化 | 第65-66页 |
| ·重组蛋白 FLAG-CD、FLAG-R9-CD、R9-FLAG-CD 的制备 | 第66-69页 |
| ·重组质粒 pSUMO-FLAG-CD、pSUMO-FLAG-R9-CD、pSUMO-R9-FLAG-CD 的构建 | 第66-67页 |
| ·重组质粒的表达 | 第67-68页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第68-69页 |
| ·R9-CD 穿膜能力的检测 | 第69-70页 |
| ·FLAG 标签的 Western blot 检测结果分析 | 第69页 |
| ·R9-CD 蛋白穿膜活性的 HepG2 细胞检测 | 第69-70页 |
| ·R9-CD、R9-CDMUT 的细胞毒作用 | 第70页 |
| ·R9-CD、R9-CDMUT 体内抗肿瘤活性 | 第70-73页 |
| ·H22 肿瘤模型存活曲线的绘制 | 第71页 |
| ·肿瘤模型的 HE 染色观察结果 | 第71-73页 |
| 5 讨论 | 第73-76页 |
| ·细胞穿膜肽的选择 | 第73页 |
| ·表达载体的构建与选择 | 第73-74页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第74-75页 |
| ·细胞穿膜肽的穿膜机制 | 第75页 |
| ·细胞穿膜肽在肿瘤治疗领域的应用 | 第75-76页 |
| 6 结论 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-81页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第81页 |
