| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-36页 |
| ·手性现象及手性醇应用概况 | 第15页 |
| ·手性现象及其重要性 | 第15页 |
| ·手性醇在制药工业中的应用概况 | 第15页 |
| ·手性化合物及手性醇的制备技术介绍 | 第15-18页 |
| ·手性源法 | 第16页 |
| ·拆分法 | 第16-17页 |
| ·不对称合成 | 第17-18页 |
| ·醇脱氢酶(ADH) | 第18-23页 |
| ·醇脱氢酶概述 | 第18页 |
| ·醇脱氢酶的结构和催化机理 | 第18-19页 |
| ·醇脱氢酶在手性醇合成中的应用进展 | 第19-23页 |
| ·醇脱氢酶的其他用途 | 第23页 |
| ·醇脱氢酶基因的克隆和表达 | 第23-28页 |
| ·醇脱氢酶的来源 | 第23-25页 |
| ·醇脱氢酶基因工程研究现状 | 第25-27页 |
| ·应用生物信息学分析指导生物催化剂基因的发现与获取 | 第27-28页 |
| ·克隆未知新基因技术的研究进展 | 第28-35页 |
| ·功能克隆(functional cloning ) | 第29页 |
| ·表型克隆(phenotypic cloning) | 第29-31页 |
| ·图位克隆(map-based cloning) | 第31页 |
| ·转座子标签技术(transposon tagging) | 第31页 |
| ·TAIL-PCR技术及其应用 | 第31-35页 |
| ·本工作的立题意义及研究内容 | 第35-36页 |
| 第2章 高加索乳杆菌醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 | 第36-67页 |
| ·实验材料 | 第36-39页 |
| ·菌种和质粒 | 第36页 |
| ·培养基 | 第36-37页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第37-38页 |
| ·试剂 | 第38页 |
| ·主要仪器和设备 | 第38-39页 |
| ·实验方法 | 第39-46页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第39页 |
| ·高加索乳杆菌基因组总DNA的提取 | 第39页 |
| ·生物信息学指导PCR简并引物的设计 | 第39-40页 |
| ·PCR扩增醇脱氢酶基因核心片段 | 第40页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳PCR产物 | 第40-41页 |
| ·DNA片段的回收 | 第41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12 法） | 第41-42页 |
| ·亚克隆片段与T载体的连接及大肠杆菌质粒转化 | 第42页 |
| ·阳性重组子的筛选及鉴定 | 第42页 |
| ·大肠杆菌质粒的分离 | 第42-43页 |
| ·TAIL-PCR法扩增醇脱氢酶基因核心片段的两端侧翼序列 | 第43-45页 |
| ·醇脱氢酶基因全长序列的拼接、PCR扩增、克隆和测序 | 第45-46页 |
| ·实验结果 | 第46-63页 |
| ·高加索乳杆菌基因组总DNA的提取 | 第46-47页 |
| ·醇脱氢酶基因核心片段的扩增 | 第47-54页 |
| ·TAIL-PCR扩增3’端侧翼序列 | 第54-57页 |
| ·TAIL-PCR扩增5’端侧翼序列 | 第57-59页 |
| ·醇脱氢酶基因全长序列的拼接、克隆和测序 | 第59-61页 |
| ·醇脱氢酶基因的序列分析 | 第61-63页 |
| ·讨论 | 第63-66页 |
| ·小结 | 第66-67页 |
| 第3章 重组醇脱氢酶基因工程菌的构建及表达条件优化 | 第67-83页 |
| ·实验材料 | 第67-69页 |
| ·菌种和质粒 | 第67页 |
| ·培养基 | 第67页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第67-68页 |
| ·主要生化试剂 | 第68-69页 |
| ·主要仪器和设备 | 第69页 |
| ·实验方法 | 第69-70页 |
| ·工程菌株的培养与诱导 | 第69页 |
| ·SDS-PAGE蛋白电泳 | 第69-70页 |
| ·醇脱氢酶活性的测定方法 | 第70页 |
| ·实验结果 | 第70-79页 |
| ·LK-adh重组酶表达质粒及工程菌的构建 | 第70-72页 |
| ·醇脱氢酶工程菌的诱导表达 | 第72-74页 |
| ·重组酶表达条件的优化 | 第74-79页 |
| ·讨论 | 第79-80页 |
| ·小结 | 第80-83页 |
| 第4章 重组酶的分离纯化、鉴定及酶学性质初步研究 | 第83-104页 |
| ·实验材料 | 第83-85页 |
| ·菌种 | 第83页 |
| ·培养基 | 第83页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第83-85页 |
| ·主要生化试剂 | 第85页 |
| ·主要仪器和设备 | 第85页 |
| ·实验方法 | 第85-90页 |
| ·工程菌株的培养与诱导 | 第85-86页 |
| ·天然金属螯合亲和层析纯化带His-tag的可溶性蛋白 | 第86页 |
| ·金属螯合亲和层析一步纯化和复性重组蛋白 | 第86页 |
| ·透析袋的预处理 | 第86-87页 |
| ·包涵体复性透析 | 第87页 |
| ·Bradford法测定蛋白浓度 | 第87页 |
| ·醇脱氢酶活性的测定 | 第87-88页 |
| ·醇脱氢酶不对称还原反应 | 第88页 |
| ·气相色谱分析方法 | 第88页 |
| ·底物特异性试验 | 第88页 |
| ·酶学性质试验方法 | 第88-90页 |
| ·实验结果 | 第90-102页 |
| ·重组醇脱氢酶的分离纯化 | 第90-94页 |
| ·醇脱氢酶的类别鉴定 | 第94-95页 |
| ·酶的底物特异性 | 第95-96页 |
| ·酶的最适反应pH值 | 第96-97页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第97页 |
| ·不同类型添加剂对酶活力的影响 | 第97-99页 |
| ·酶的稳定性 | 第99-100页 |
| ·动力学常数K_m的测定 | 第100-102页 |
| ·讨论 | 第102-103页 |
| ·小结 | 第103-104页 |
| 第5章 LK-ADH在高加索乳杆菌中表达的初步研究 | 第104-115页 |
| ·实验材料 | 第104-105页 |
| ·菌种和质粒 | 第104页 |
| ·培养基 | 第104页 |
| ·酶和试剂 | 第104-105页 |
| ·实验方法 | 第105-107页 |
| ·工程菌E.coli DH5α/pLY5-adhR的培养及蛋白表达 | 第105页 |
| ·L.kefir和E.coli DH5α/pLY5-adhR工程菌细胞转化反应 | 第105页 |
| ·L.kefir DSM20587 菌株总RNA提取 | 第105-106页 |
| ·RT-PCR方法 | 第106-107页 |
| ·实验结果 | 第107-113页 |
| ·高加索乳杆菌(R)-醇脱氢酶基因LK-adhR的克隆及工程菌构建 | 第107-108页 |
| ·L.kefir和E.coli DH5α/pLY5-adhR工程菌细胞转化反应 | 第108-109页 |
| ·LK-adh的RT-PCR结果 | 第109-112页 |
| ·LK-adh(R)的RT-PCR结果 | 第112-113页 |
| ·讨论 | 第113-114页 |
| ·小结 | 第114-115页 |
| 全文总结 | 第115-116页 |
| 本课题创新点 | 第116-117页 |
| 对进一步开展研究工作的设想和建议 | 第117-118页 |
| 攻读学位期间发表的论文、申请的专利及综述报告 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 附录 | 第128-138页 |
