| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第11-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-31页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征 | 第13-26页 |
| ·PRRS的危害及流行病学特点 | 第13-14页 |
| ·PRRSV分类 | 第14-15页 |
| ·PRRSV理化特性 | 第15页 |
| ·PRRSV抗原性 | 第15页 |
| ·PRRSV分子生物学研究进展 | 第15-20页 |
| ·PRRSV的基因组变异和RNA重组 | 第20-21页 |
| ·PRRSV的免疫学反应 | 第21-23页 |
| ·PRRS疫苗研究进展 | 第23-26页 |
| ·CD154 | 第26-31页 |
| ·CD154基因及蛋白结构 | 第26-27页 |
| ·CD154生物学特性 | 第27-28页 |
| ·CD154生物学功能 | 第28页 |
| ·CD154在疾病治疗中的应用 | 第28-31页 |
| 第2章 研究的目的与意义 | 第31-32页 |
| 第3章 材料与方法 | 第32-51页 |
| ·实验材料 | 第32-39页 |
| ·细胞、毒株、试验动物 | 第32页 |
| ·质粒、载体 | 第32-35页 |
| ·本研究中所用的寡核苷酸引物 | 第35页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第35-36页 |
| ·反应试验所用抗原及血清 | 第36页 |
| ·培养基及主要试剂的配制 | 第36-37页 |
| ·主要缓冲液与相关试剂及其配制 | 第37-39页 |
| ·试验方法 | 第39-51页 |
| ·猪外周血单核细胞(PBMC)的分离及培养 | 第39-40页 |
| ·猪淋巴细胞RNA的提取 | 第40页 |
| ·CD154基因的RT-PCR扩增与检测 | 第40-41页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第41页 |
| ·PCR产物或酶切产物的电泳检测 | 第41页 |
| ·线性质粒DNA末端去磷酸化 | 第41页 |
| ·PCR产物或酶切产物回收与纯化 | 第41-42页 |
| ·外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第42页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第42-43页 |
| ·连接产物的转化 | 第43页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第43-44页 |
| ·质粒的大量制备(碱裂解法) | 第44-45页 |
| ·质粒DNA含量的测定 | 第45页 |
| ·重组质粒(阳性质粒)的鉴定 | 第45页 |
| ·质粒转染(脂质体介导转染法) | 第45页 |
| ·诱导表达 | 第45-46页 |
| ·用于SDS-PAGE电泳的包涵体提取 | 第46页 |
| ·用于ELISA抗原的包涵体的提取 | 第46页 |
| ·ELISA最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定(方阵滴定) | 第46页 |
| ·Western blot检测目的蛋白的体外表达 | 第46-48页 |
| ·多克隆抗体制备 | 第48页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第48页 |
| ·间接ELISA试验 | 第48-49页 |
| ·动物试验 | 第49页 |
| ·细胞免疫的检测 | 第49-50页 |
| ·统计学方法 | 第50-51页 |
| 第4章 结果与分析 | 第51-61页 |
| ·猪CD154基因原核及真核表达质粒的构建与体外表达检测 | 第51-54页 |
| ·猪CD154全长基因RT-PCR扩增与克隆 | 第51页 |
| ·CD154基因缺失突变体的PCR扩增 | 第51-52页 |
| ·原核表达质粒pQE80-tCD154的构建及鉴定 | 第52页 |
| ·CD154基因在大肠杆菌中的表达 | 第52-53页 |
| ·Western-blot检测 | 第53页 |
| ·真核表达质粒的构建及鉴定 | 第53页 |
| ·真核表达质粒在HeLa细胞中的表达与细胞定位 | 第53-54页 |
| ·CD154多抗的制备 | 第54页 |
| ·PRRSV ORF5基因与猪CD154基因共表达及融合表达质粒的构建与体外表达检测 | 第54-59页 |
| ·PRRSV ORF5基因与猪CD154基因共表达质粒的构建 | 第55-56页 |
| ·PRRSV ORF5n60与猪CD154基因缺失突变体融合表达质粒的构建 | 第56-58页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测ORF5基因的表达 | 第58-59页 |
| ·PRRSV ORF5基因与猪CD154基因共表达及融合表达DNA疫苗诱导小鼠免疫反应结果 | 第59-61页 |
| ·免疫小鼠的ELISA抗体水平 | 第59-60页 |
| ·免疫小鼠诱导的T细胞增殖反应比较 | 第60-61页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第61-70页 |
| ·讨论 | 第61-64页 |
| ·PRRS新型疫苗靶基因的选择 | 第61页 |
| ·优良免疫佐剂的选择 | 第61-62页 |
| ·猪CD154基因及ORF5基因的克隆、鉴定及序列分析 | 第62页 |
| ·猪CD154基因的原核表达、蛋白活性检测 | 第62页 |
| ·猪CD154蛋白在细胞中的定位 | 第62页 |
| ·真核表达载体的选择 | 第62页 |
| ·融合表达疫苗中ORF5基因缺失突变体的选择 | 第62-63页 |
| ·猪CD154与ORF5基因融合表达和共表达PRRSV DNA疫苗诱导的免疫反应 | 第63页 |
| ·PRRS新型疫苗的发展前景 | 第63-64页 |
| ·结论 | 第64-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 附录 | 第71页 |
