| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 英文缩略词表 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| ·关于 Gateway技术 | 第12-14页 |
| ·Gateway技术介绍 | 第12-13页 |
| ·Gateway技术原理 | 第13-14页 |
| ·本课题所应用的 Gateway技术 | 第14页 |
| ·关于慢病毒表达系统 | 第14-18页 |
| ·慢病毒介绍 | 第14-15页 |
| ·病毒载体简介 | 第15页 |
| ·HIV慢病毒载体介绍 | 第15-17页 |
| ·HIV慢病毒 | 第15-16页 |
| ·HIV慢病毒载体介绍 | 第16-17页 |
| ·ViraPower慢病毒系统介绍 | 第17-18页 |
| ·关于bFGF | 第18-21页 |
| ·CHO细胞介绍 | 第21页 |
| ·本课题的研究目的和意义 | 第21-22页 |
| ·技术路线 | 第22-24页 |
| ·路线 | 第22页 |
| ·具体路线 | 第22-24页 |
| 第二章 实验试剂与器材 | 第24-32页 |
| ·主要仪器 | 第24-25页 |
| ·主要易耗品 | 第25页 |
| ·主要工具酶和试剂盒 | 第25页 |
| ·主要细胞株和质粒 | 第25-26页 |
| ·主要试剂及配方 | 第26-32页 |
| ·主要试剂和药品 | 第26-27页 |
| ·基因克隆技术主要试剂及配方 | 第27-28页 |
| ·DEPC水 | 第27页 |
| ·LB培养基和平板 | 第27页 |
| ·DNA电泳缓冲液 TAE和琼脂糖凝胶 | 第27-28页 |
| ·细胞培养技术主要试剂及配方 | 第28-29页 |
| ·0.1mol/L PBS(pH 7.4) | 第28页 |
| ·含0.02% EDTA的0.25%的胰蛋白酶 | 第28-29页 |
| ·蛋白质技术主要试剂及配方 | 第29-31页 |
| ·SDS-PAGE所用试剂及配方 | 第29页 |
| ·Werstern Blot所用试剂及配方 | 第29-30页 |
| ·银染所用试剂及配方 | 第30-31页 |
| ·慢病毒系统所用试剂配方 | 第31-32页 |
| 第三章 实验方法与技术 | 第32-51页 |
| ·基因工程技术 | 第32-37页 |
| ·细菌培养和质粒扩增 | 第32页 |
| ·菌体和质粒的冻存 | 第32页 |
| ·质粒的抽提 | 第32-33页 |
| ·质粒的酒精沉淀 | 第33页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳及目的条带的切胶回收 | 第33-34页 |
| ·DNA的酶切 | 第34页 |
| ·PCR | 第34页 |
| ·感受态菌体的制备 | 第34-35页 |
| ·用于 CaCl_2转化法的感受态菌体的制备 | 第34-35页 |
| ·用于电穿孔转化法的感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·转化法 | 第35页 |
| ·CaCl_2转化法 | 第35页 |
| ·电穿孔转化法 | 第35页 |
| ·转化子的鉴定 | 第35-36页 |
| ·RNAs的提取 | 第36页 |
| ·RT-PCR | 第36-37页 |
| ·基因组的提取 | 第37页 |
| ·细胞培养技术 | 第37-39页 |
| ·细胞培养 | 第37-38页 |
| ·细胞传代 | 第38页 |
| ·细胞冻存 | 第38页 |
| ·细胞复苏 | 第38-39页 |
| ·蛋白质技术 | 第39-41页 |
| ·SDS-PAGE | 第39-40页 |
| ·Western Blot | 第40-41页 |
| ·银染技术 | 第41页 |
| ·Gateway技术 | 第41-46页 |
| ·引物的设计 | 第41-42页 |
| ·attB-bFGF-attB形式基因的获得 | 第42-43页 |
| ·BP反应 | 第43-44页 |
| ·入门克隆的酶切鉴定 | 第43-44页 |
| ·入门克隆的 PCR鉴定 | 第44页 |
| ·LR反应 | 第44-46页 |
| ·表达克隆的酶切鉴定 | 第45页 |
| ·表达克隆的 PCR鉴定 | 第45-46页 |
| ·慢病毒系统技术 | 第46-48页 |
| ·X-gal染色技术 | 第46页 |
| ·杀伤曲线的制作 | 第46-47页 |
| ·慢病毒的包装 | 第47页 |
| ·慢病毒的感染 | 第47-48页 |
| ·单克隆细胞的挑选 | 第48页 |
| ·CHO-bFGF细胞的检测 | 第48-51页 |
| ·基因组水平的检测 | 第48-49页 |
| ·cDNAs水平的检测 | 第49-50页 |
| ·MTT生物活性检测法 | 第50-51页 |
| 第四章 实验结果与结论 | 第51-67页 |
| ·表达克隆的获得 | 第51-57页 |
| ·C2C12细胞cDNAs的获取 | 第51页 |
| ·引物的设计 | 第51-52页 |
| ·attB-bFGF-attB形式基因的制备 | 第52页 |
| ·入门克隆的获得 | 第52-55页 |
| ·BP反应 | 第52页 |
| ·入门克隆的鉴定 | 第52-55页 |
| ·酶切鉴定 | 第53页 |
| ·PCR鉴定 | 第53-54页 |
| ·测序鉴定 | 第54-55页 |
| ·表达克隆的获得 | 第55-57页 |
| ·LR反应 | 第55页 |
| ·表达克隆的鉴定 | 第55-57页 |
| ·酶切鉴定 | 第55-56页 |
| ·PCR鉴定 | 第56-57页 |
| ·测序鉴定 | 第57页 |
| ·表达克隆的扩增 | 第57页 |
| ·慢病毒的包装和感染 | 第57-61页 |
| ·表达克隆的酒精沉淀 | 第58页 |
| ·慢病毒的包装 | 第58-59页 |
| ·慢病毒感染效率的检测 | 第59页 |
| ·bFGF-慢病毒对 CHO-K1的感染和阳性克隆的筛选 | 第59-61页 |
| ·CHO-bFGF细胞株的检测 | 第61-65页 |
| ·基因组水平的检测 | 第61-62页 |
| ·cDNAs水平的检测 | 第62-63页 |
| ·蛋白水平的检测 | 第63-64页 |
| ·活性检测 | 第64-65页 |
| ·结论 | 第65-67页 |
| 第五章 讨论与展望 | 第67-72页 |
| ·讨论 | 第67-71页 |
| ·Gateway技术应用中出现的问题及讨论 | 第67-68页 |
| ·重组反应后的序列突变问题 | 第67页 |
| ·筛选基因ccdB的突变问题 | 第67-68页 |
| ·Gateway技术应用心得 | 第68页 |
| ·慢病毒表达系统应用中的问题及讨论 | 第68-69页 |
| ·慢病毒包装中的问题 | 第68页 |
| ·慢病毒感染中的问题 | 第68-69页 |
| ·慢病毒表达系统应用心得 | 第69页 |
| ·有关bFGF的问题及讨论 | 第69-70页 |
| ·CHO-bFGF细胞株培养液活性提高的问题 | 第69-70页 |
| ·CHO-bFGF细胞株是否高效分泌bFGF的问题 | 第70页 |
| ·检测方法的问题 | 第70-71页 |
| ·展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 附录 | 第76-81页 |
| 附录1 pDONR221图谱 | 第76-77页 |
| 附录2 pLenti6/V5-GW/lacZ图谱 | 第77-78页 |
| 附录3 pLenti6/V5-DEST图谱 | 第78-79页 |
| 附录4 pDONR-bFGF测序图谱 | 第79-80页 |
| 附录5 pLenti6/V5-bFGF测序图谱 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |