| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 第一章 引言 | 第13-22页 |
| 1 研究目的和意义 | 第13页 |
| 2 国内外研究现状 | 第13-21页 |
| ·产生角蛋白酶的微生物 | 第14-15页 |
| ·真菌 | 第14页 |
| ·放线菌 | 第14页 |
| ·细菌 | 第14-15页 |
| ·角蛋白酶的理化性质 | 第15-16页 |
| ·底物特异性 | 第15页 |
| ·分子量 | 第15页 |
| ·最适pH值和最适温度 | 第15-16页 |
| ·蛋白酶抑制剂和各种离子的作用 | 第16页 |
| ·其它 | 第16页 |
| ·角蛋白的酶解机理 | 第16-17页 |
| ·变性作用 | 第16-17页 |
| ·水解作用 | 第17页 |
| ·转氨基作用 | 第17页 |
| ·角蛋白酶的分子生物学研究进展 | 第17-19页 |
| ·角蛋白酶表达调控的研究进展 | 第17-18页 |
| ·角蛋白酶基因 | 第18页 |
| ·角蛋白酶的晶体结构 | 第18页 |
| ·角蛋白酶的基因工程 | 第18-19页 |
| ·角蛋白酶的应用前景 | 第19-20页 |
| ·饲料和饲料添加剂 | 第19页 |
| ·农药 | 第19页 |
| ·医药和化妆品 | 第19页 |
| ·角蛋白酶与疯牛病 | 第19页 |
| ·其它用途 | 第19-20页 |
| ·问题与展望 | 第20-21页 |
| ·目前存在的问题 | 第20页 |
| ·展望和对策 | 第20-21页 |
| 3 研究内容和方法 | 第21-22页 |
| ·研究内容及目标 | 第21页 |
| ·研究方法 | 第21-22页 |
| 第二章 蛋白酶基因的克隆 | 第22-59页 |
| 1 材料与方法 | 第22-30页 |
| ·实验材料和实验设备 | 第22页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·引物合成 | 第22页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第22页 |
| ·溶液 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·实验仪器 | 第22页 |
| ·实验方法 | 第22-30页 |
| ·弗氏链霉菌k11(Streptomyces fradiae var. k11)对羽毛和头发的降解 | 第22-23页 |
| ·弗氏链霉菌k11的诱导产酶 | 第23页 |
| ·蛋白酶的纯化 | 第23-24页 |
| ·蛋白酶的氨基酸序列测定 | 第24页 |
| ·弗氏链霉菌k11总DNA的提取 | 第24页 |
| ·蛋白酶基因部分序列的克隆 | 第24-27页 |
| ·反向PCR | 第27页 |
| ·基因文库的构建和筛选 | 第27-30页 |
| 2 结果 | 第30-44页 |
| ·弗氏链霉菌k11(Streptomyces fradiae var. k11)降解羽毛和头发 | 第30页 |
| ·蛋白酶的纯化 | 第30-32页 |
| ·蛋白酶的氨基酸序列测定结果 | 第32页 |
| ·蛋白酶部分编码基因序列的克隆 | 第32-33页 |
| ·丝氨酸蛋白酶SFP2部分编码基因序列的克隆 | 第32页 |
| ·氨肽酶SFAP部分编码基因序列的克隆 | 第32-33页 |
| ·SFP4部分编码基因序列的克隆 | 第33页 |
| ·SFP5部分编码基因序列的克隆 | 第33页 |
| ·SFP1部分编码基因序列的克隆 | 第33页 |
| ·SFP3部分编码基因序列的克隆 | 第33页 |
| ·反向PCR结果 | 第33页 |
| ·基因文库的构建和筛选 | 第33-35页 |
| ·六种蛋白酶基因的DNA序列 | 第35-44页 |
| ·sfp2 | 第35-37页 |
| ·sfap | 第37-38页 |
| ·sfp1 | 第38-39页 |
| ·sfp3 | 第39-42页 |
| ·sfp5 | 第42-43页 |
| ·sfp4 | 第43-44页 |
| 3 讨论 | 第44-58页 |
| 本章小结 | 第58-59页 |
| 第三章 弗氏链霉菌k11蛋白酶基因的表达研究 | 第59-66页 |
| 1.材料与方法 | 第59-62页 |
| 1 .1实验材料 | 第59页 |
| ·菌株 | 第59页 |
| ·引物合成 | 第59页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第59页 |
| ·培养基 | 第59页 |
| ·实验仪器 | 第59页 |
| ·实验方法 | 第59-62页 |
| ·取样 | 第59页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第59-60页 |
| ·甲醛变性电泳 | 第60页 |
| ·反转录合成cDNA第一条链 | 第60-61页 |
| ·第一轮PCR扩增 | 第61页 |
| ·第二轮PCR(nested PCR) | 第61-62页 |
| 2.结果 | 第62-64页 |
| ·第一轮PCR反应结果 | 第62-63页 |
| ·第二轮PCR反应(nested PCR)结果 | 第63-64页 |
| 3.讨论 | 第64-65页 |
| 本章小结 | 第65-66页 |
| 第四章 蛋白酶基因的异源表达 | 第66-91页 |
| 1.材料与方法 | 第66-73页 |
| ·实验材料 | 第66页 |
| ·菌株与质粒 | 第66页 |
| ·引物合成 | 第66页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第66页 |
| ·培养基 | 第66页 |
| ·实验方法 | 第66-73页 |
| ·枯草芽孢杆菌表达载体的构建 | 第66-70页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和电击转化 | 第70-71页 |
| ·枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和电击转化 | 第71页 |
| ·丝氨酸蛋白酶SFP2的表达及检测 | 第71-72页 |
| ·丝氨酸蛋白酶SFP1的表达及检测 | 第72-73页 |
| ·氨肽酶SFAP的表达及检测 | 第73页 |
| 2.结果 | 第73-85页 |
| ·枯草芽孢杆菌穿梭表达载体的构建 | 第73-75页 |
| ·组成型分泌表达穿梭载体pHY500A的构建 | 第73-74页 |
| ·蔗糖诱导分泌型穿梭表达载体pHY500S的构建 | 第74-75页 |
| ·丝氨酸蛋白酶SFP2的表达及检测 | 第75-82页 |
| ·在大肠杆菌中的表达 | 第75-78页 |
| ·在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第78-82页 |
| ·蛋白酶SFP1的表达及检测 | 第82-83页 |
| ·重组表达载体pET-22b-sfp1pro的构建 | 第82页 |
| ·SFP1的诱导表达 | 第82-83页 |
| ·氨肽酶SFAP的表达及检测 | 第83-85页 |
| ·重组表达载体pET-22b-sfap1、pET-22b-sfap2、pET-22b-sfapm1及pET-22b-sfapm2的构建 | 第83-84页 |
| ·SFAP的诱导表达 | 第84-85页 |
| 3.讨论 | 第85-90页 |
| 本章小结 | 第90-91页 |
| 第五章 蛋白酶SFP2的酶学性质 | 第91-99页 |
| 1.材料与方法 | 第91-94页 |
| ·实验材料和实验设备 | 第91页 |
| ·菌株 | 第91页 |
| ·酶、底物和生化试剂 | 第91页 |
| ·培养基 | 第91页 |
| ·实验仪器 | 第91页 |
| ·实验方法 | 第91-94页 |
| ·SFP2的表达和初步纯化 | 第91页 |
| ·蛋白酶活性测定方法 | 第91-92页 |
| ·以酪蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质 | 第92-93页 |
| ·以天青角蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质 | 第93-94页 |
| 2.结果 | 第94-98页 |
| ·以酪蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质 | 第94-95页 |
| ·SFP2的最适pH值 | 第94页 |
| ·SFP2的最适反应温度 | 第94-95页 |
| ·以天青角蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质 | 第95-98页 |
| ·SFP2最适pH值和pH稳定性的测定 | 第95页 |
| ·SFP2最适反应温度和热稳定性的测定 | 第95-96页 |
| ·抑制剂对SFP2活性的影响 | 第96-97页 |
| ·SFP2与胰蛋白酶、蛋白酶K比较 | 第97-98页 |
| 3 讨论 | 第98页 |
| 本章小结 | 第98-99页 |
| 第六章 结论 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 作者简历 | 第110页 |
