| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1．1 抗体研究概述 | 第10-11页 |
| 1．2 抗体产生技术的发展 | 第11-12页 |
| 1．2．1 免疫动物 | 第11页 |
| 1．2．2 杂交瘤技术 | 第11-12页 |
| 1．2．3 基因工程抗体 | 第12页 |
| 1．3 基因工程抗体的类型 | 第12-16页 |
| 1．3．1 鼠/人嵌合抗体 | 第12页 |
| 1．3．2 改性抗体 | 第12-13页 |
| 1．3．3 小分子抗体 | 第13-15页 |
| 1．3．4 双特异性抗体和双功能抗体 | 第15-16页 |
| 1．4 单链抗体的表达 | 第16-17页 |
| 1．5 单链抗体的应用 | 第17-18页 |
| 1．5．1 用于疾病的诊断 | 第17页 |
| 1．5．2 用于基因治疗 | 第17页 |
| 1．5．3 用于病毒性传染病的被动免疫 | 第17-18页 |
| 1．5．4 用于构建双功能抗体或者是双特异性抗体 | 第18页 |
| 1．6 本课题的意义和主要内容 | 第18-20页 |
| 1．6．1 本课题的意义 | 第18-19页 |
| 1．6．2 本课题的主要内容 | 第19-20页 |
| 第二章 实验材料 | 第20-25页 |
| 2．1 主要仪器 | 第20页 |
| 2．2 实验材料 | 第20-25页 |
| 2．2．1 宿主菌 | 第20页 |
| 2．2．2 质粒载体与 PCR引物 | 第20-21页 |
| 2．2．3 抗体和抗原 | 第21页 |
| 2．2．4 酶类 | 第21页 |
| 2．2．5 试剂盒 | 第21页 |
| 2．2．6 一般试剂 | 第21-22页 |
| 2．2．7 层析填料 | 第22页 |
| 2．2．8 常用培养基、缓冲液及储备缓冲液 | 第22-25页 |
| 第三章 实验方法 | 第25-40页 |
| 3．1 质粒pQE40和宿主菌M15[pREP4]简介 | 第25-26页 |
| 3．2 表达质粒构建流程图 | 第26页 |
| 3．3 单链抗体基因的获取 | 第26-28页 |
| 3．3．1 PCR引物设计 | 第26页 |
| 3．3．2 PCR扩增单链抗基因 | 第26-28页 |
| 3．4 表达质粒pQE40-scFv的构建和鉴定 | 第28-29页 |
| 3．5 单链抗体的表达分析 | 第29-30页 |
| 3．5．1 重组子 M15[pQE40-scFv]的诱导表达 | 第29页 |
| 3．5．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第29页 |
| 3．5．3 蛋白印迹(Western blotting)分析 | 第29-30页 |
| 3．6 单链抗体的表达优化 | 第30页 |
| 3．6．1 诱导起始密度的优化 | 第30页 |
| 3．6．2 诱导时间的优化 | 第30页 |
| 3．7 包涵体的制备 | 第30-31页 |
| 3．7．1 菌体破碎 | 第30-31页 |
| 3．7．2 包涵体的洗涤 | 第31页 |
| 3．8 变性条件 scFv的纯化 | 第31页 |
| 3．8．1 Ni离子金属螯合亲和层析 | 第31页 |
| 3．8．2 凝胶层析 | 第31页 |
| 3．9 复性方法的选择 | 第31-33页 |
| 3．9．1 不同复性方式的比较 | 第31-32页 |
| 3．9．2 基本复性方案 | 第32页 |
| 3．9．3 蛋白浓度的影响 | 第32页 |
| 3．9．4 稳定剂的比较 | 第32-33页 |
| 3．10 部分理化性质的鉴定 | 第33-34页 |
| 3．10．1 分子量的精确测定 | 第33页 |
| 3．10．2 单链抗体 N末端氨基酸序列的手工测定 | 第33-34页 |
| 3．10．3 等电点的测定 | 第34页 |
| 3．11 链抗体生物学活性的鉴定 | 第34-36页 |
| 3．11．1 兔抗血清的制备和纯化 | 第34页 |
| 3．11．2 间接 ELISA | 第34-35页 |
| 3．11．3 竞争 ELISA | 第35页 |
| 3．11．4 单链抗体亲和常数的测定 | 第35-36页 |
| 3．11．5 单链抗体相对比效价测定方法的建立 | 第36页 |
| 3．12 本实验常用实验方法汇总 | 第36-40页 |
| 3．12．1 质粒的小量提取 | 第36-37页 |
| 3．12．2 感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 3．12．3 宿主菌的转化 | 第37-38页 |
| 3．12．4 琼脂糖凝胶电泳 | 第38页 |
| 3．12．5 琼脂糖凝胶电泳胶回收 | 第38页 |
| 3．12．6 聚丙烯酞胺凝胶电泳 | 第38-39页 |
| 3．12．7 蛋白浓度的测定 | 第39-40页 |
| 第四章 结果与讨论 | 第40-59页 |
| 4．1 重组子 M15[pQE40-scFv]的构建 | 第40-41页 |
| 4．1．1 scFv基因的获得 | 第40页 |
| 4．1．2 重组子的鉴定 | 第40-41页 |
| 4．1．3 DNA测序结果 | 第41页 |
| 4．2 重组子 M15[pQE40-scFv]的诱导表达分析结果 | 第41-42页 |
| 4．2．1 SDS-PAGE分析结果 | 第41-42页 |
| 4．2．2 Western blotting分析结果 | 第42页 |
| 4．3 单链抗体表达条件的优化结果 | 第42-43页 |
| 4．4 单链抗体的纯化结果 | 第43-44页 |
| 4．4．1 Ni离子金属螯合亲和层析结果 | 第44页 |
| 4．4．2 凝胶层析结果 | 第44页 |
| 4．5 复性的结果 | 第44-49页 |
| 4．5．1 不同复性方式的比较 | 第44-47页 |
| 4．5．2 复性条件的优化 | 第47-49页 |
| 4．6 部分理化性质的鉴定结果 | 第49-52页 |
| 4．6．1 分子量的精确测定结果 | 第49-50页 |
| 4．6．2 单链抗体N末端氨基酸序列的手工测定结果 | 第50-51页 |
| 4．6．3 等电点的测定结果 | 第51-52页 |
| 4．7 单链抗体生物学活性的鉴定结果 | 第52-56页 |
| 4．7．1 间接 ELISA结果 | 第52-53页 |
| 4．7．2 竞争ELISA结果 | 第53页 |
| 4．7．3 单链抗体亲和常数的测定结果 | 第53-54页 |
| 4．7．4 单链抗体相对比效价的测定方法 | 第54-56页 |
| 4．8 讨论 | 第56-59页 |
| 4．8．1 关于单链抗体的纯化 | 第56-57页 |
| 4．8．2 关于单链抗体的复性 | 第57-58页 |
| 4．8．3 关于单链抗体效价的测定 | 第58-59页 |
| 第五章 结论与展望 | 第59-61页 |
| 5．1 结论 | 第59页 |
| 5．2 展望 | 第59-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 在读期间发表论文情况 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
