| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-13页 |
| 前言 | 第13-21页 |
| 材料与方法 | 第21-45页 |
| 一、材料 | 第21-23页 |
| 1.BAC克隆 | 第21页 |
| 2.菌株与质粒 | 第21-22页 |
| 3.实验用小鼠及高脂饲料 | 第22页 |
| 4.限制性内切酶及修饰酶 | 第22页 |
| 5.其它主要试剂 | 第22页 |
| 6.放射性核素 | 第22页 |
| 7.主要仪器设备 | 第22-23页 |
| 二、实验方法 | 第23-45页 |
| 1.BAC介导的人Apo AI-CIII-AVI-AV基因簇转基因鼠的基本技术路线 | 第23-25页 |
| 2.含完整人的载脂蛋白基因簇的BAC DNA的鉴定 | 第25-27页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第25页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第25页 |
| ·BAC DNA的末端直接测序 | 第25-26页 |
| ·利用原位荧光杂交(FISH)对BAC DNA进行染色体定位 | 第26页 |
| ·BAC DNA的部分限制性内切酶酶切图谱分析 | 第26-27页 |
| 3.利用同源重组从BAC DNA中删除apoC-Ⅲ增强子核心序列 | 第27-30页 |
| ·利用同源重组在E.coli中对BAC进行修饰的技术路线 | 第27-28页 |
| ·用于重组的穿梭载体的构建 | 第28-30页 |
| ·突变盒序列的PCR扩增和PCR产物回收 | 第29页 |
| ·连接反应 | 第29页 |
| ·感受态细胞制备 | 第29页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第29-30页 |
| ·克隆筛选 | 第30页 |
| ·含有BAC DNA的感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·感受态细胞的转化及重组体的正筛选 | 第30页 |
| ·镰孢菌酸(FA)反筛选确定突变BAC克隆 | 第30页 |
| ·Southern杂交鉴定BAC突变体 | 第30页 |
| 4.显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第30-31页 |
| 5.受精卵培养基的配制与保存 | 第31页 |
| ·贮存液的成分及配制 | 第31页 |
| ·M2和M16工作液的配制 | 第31页 |
| 6.小鼠的选择与处理 | 第31-32页 |
| 7.超排卵和取卵 | 第32页 |
| 8.显微注射 | 第32-36页 |
| ·持卵针的制备 | 第32-35页 |
| ·显微注射针的拉制 | 第35页 |
| ·显微注射槽的制备 | 第35页 |
| ·显微注射 | 第35-36页 |
| 9.输卵管移卵 | 第36-38页 |
| ·移卵针的制备 | 第36页 |
| ·受精卵在移卵针中的排列 | 第36页 |
| ·输卵管移卵 | 第36-38页 |
| 10.鼠尾基因组DNA的提取 | 第38页 |
| 11.利用PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第38-39页 |
| ·PCR法鉴定转基因鼠 | 第39页 |
| ·Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第39页 |
| 12.小鼠器官组织的采集和保存 | 第39页 |
| 13.转基因小鼠传代 | 第39-40页 |
| 14.组织RNA提取 | 第40页 |
| 15.RNase保护实验检测转基因小鼠中人载脂蛋白转基因的表达 | 第40-43页 |
| ·保护实验探针质粒的构建 | 第40-41页 |
| ·RNA探针的标记 | 第41-42页 |
| ·RNA探针的纯化 | 第42页 |
| ·RNA：RNA杂交 | 第42页 |
| ·RNase反应、变性胶电泳及放射自显影 | 第42-43页 |
| 16.半定量RT-PCR检测转基因鼠中外源基因表达情况 | 第43页 |
| ·提取细胞总RNA | 第43页 |
| ·反转录成cDNA第一链 | 第43页 |
| ·半定量RT-PCR | 第43页 |
| 17.小鼠外周血血脂浓度的检测 | 第43-45页 |
| 实验结果 | 第45-66页 |
| 一、含完整人Apo AI-CIII-AIV-AV基因簇的BAC克隆的鉴定 | 第45-46页 |
| 1.脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析BAC阳性克隆 | 第45页 |
| 2.Southern杂交和PCR鉴定克隆所含基因簇 | 第45页 |
| 3.利用FISH对BAC286I4进行染色体定位 | 第45-46页 |
| 4.BAC286I4的末端直接测序 | 第46页 |
| 5.BAC286I4的部分限制性内切酶酶切图谱分析 | 第46页 |
| 二、利用同源重组从BAC286I4克隆中定位删除apoC-Ⅲ增强子核心序列 | 第46-56页 |
| 1.用于重组的穿梭载体pSV-RecA-△CIII enhancer的构建 | 第46-52页 |
| 2.穿梭载体在含BAC286I4大肠杆菌细胞中的同源重组和重组体的正负筛选 | 第52-54页 |
| 3.利用Southern杂交和序列测定鉴定BAC286I4的突变体 | 第54-56页 |
| 三、显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第56-57页 |
| 四、转基因小鼠系的建立 | 第57-66页 |
| 1.BAC介导的人Apo AI-CIII-AIV-AV基因簇转基因小鼠系的建立 | 第57-59页 |
| 2.转基因小鼠中人载脂蛋白基因的表达分析 | 第59-63页 |
| 3.转基因小鼠血清脂质水平的检测 | 第63-64页 |
| 4.apo BACM1转基因小鼠系的建立 | 第64-66页 |
| 讨论 | 第66-74页 |
| 一、ApoA-Ⅰ C-Ⅲ A-Ⅳ A-Ⅴ基因簇研究现状 | 第67-68页 |
| 二、包含人类基因组DNA片段的BAC克隆用于转基因动物研究 | 第68-69页 |
| 三、ApoA-Ⅰ C-Ⅲ A-Ⅳ A-Ⅴ基因簇转基因小鼠模型与相关模型的比较 | 第69-71页 |
| 四、进一步的实验 | 第71-72页 |
| 五、生物信息学、基因芯片等新学科、新技术的重要性 | 第72页 |
| 六、研究工作的不足及改进 | 第72-73页 |
| 七、展望 | 第73-74页 |
| 小结 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 文献综述 | 第81-87页 |
| 英文名词及缩写 | 第87-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
